حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال
Summary
ويتحقق عالية الدقة حيوي داخلي التصوير مع تعزيز النقيض تصل إلى 120 ميكرومتر في عمق الغدد الليمفاوية من الفئران الكبار عن طريق تحوير مكانيا نمط الإثارة من متعدد التنسيق المجهر ثنائي الفوتون. في عمق 100 ميكرون قمنا بقياس قرارات من 487 نانومتر (الأفقي) و 551 نانومتر (المحوري)، وبالتالي الالتفاف على تشتت وحيود حدود.
Abstract
رصد الاتصالات الخلوية من قبل حيوي داخلي الأنسجة العميقة متعددة الفوتون المجهري هو المفتاح لفهم مصير الخلايا المناعية داخل عينات من الأنسجة سميكة والأجهزة في الصحة والمرض. من خلال التحكم في نمط المسح في متعدد الفوتون المجهري وتطبيق الخوارزميات العددية المناسبة، قمنا بتطوير نهج مخطط في الإضاءة، والتي مكنتنا من تحقيق 3 أضعاف أفضل قرار محوري وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، أي النقيض من ذلك، في أكثر من 100 عمق الأنسجة ميكرون داخل نثر غاية أنسجة الأجهزة اللمفاوية بالمقارنة مع معيار متعدد الفوتون المجهري. سرعة اكتساب وكذلك photobleaching من photodamage والآثار كانت مشابهة لتقنية تستند الصور مضاعف القياسية، في حين كان عمق التصوير أقل قليلا نظرا لاستخدام أجهزة الكشف الميداني. باستخدام نهج مخطط في الإضاءة، ونحن قادرون على مراقبة ديناميات الودائع مجمع المناعي على الخلايا الجذعية الجريبي الثانوية ̵1؛ على مستوى عدد قليل من جزيئات البروتين في مراكز جرثومي.
Introduction
ثنائي الفوتون الليزر المجهر (TPLSM)، مع مزاياها للتصوير الأنسجة العميقة المتصلة الأشعة تحت الحمراء فائقة قصيرة الإثارة نابض 1، وقد رأينا ثورة على العمليات الحيوية على مستوى الخلية واحد من خلال الكشف عن الحركة والتفاعل أنماط مختلفة مجموعات فرعية الخلايا في الحيوانات التي تعيش 2-5. ومع ذلك، التكنولوجيا الحالية لا تزال غير كافية لتوضيح آليات وظيفة الجهاز وضعف كشرط أساسي لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة، لأنه يجعل سوى معلومات قليلة حول الأساس الجزيئي للاستجابة الخلوية داخل أنسجة في الصحة والمرض. التكنولوجيا الحالية تتيح سوى نافذة المكاني لبضع مئات من ميكرون بسبب تناثر وموجة آثار تشويه الجبهة على القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء 6، والتي هي واضحة وخاصة في الأنسجة المدمجة للغاية من الحيوانات البالغة. هذه نثر وآثار موجة تشويه الجبهة هي نتيجة لوغير متجانسة للغايةتوزيع متباين الخواص د معامل الانكسار في الأنسجة، مما يؤدي في خطوة أولى إلى تدهور تعتمد عمق القرار المكانية 3D وأخيرا إلى فقدان تام للإشارة القادمة من الفوتونات الإثارة الباليستية، أي فقدان نسبة الإشارة إلى الضوضاء. من حيث bioscientific والطبية الحيوية التطبيقات الأنسجة العميقة، وهذا يعني أن التكنولوجيا الحالية غير قادرة على الكشف لا لبس فيه الاتصالات الخلوية بسبب ضعف القرار من شأنه أن يؤدي إلى تفاعلات إيجابية زورا حين أن انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء من شأنه أن يتسبب في النظام نغفل بعض التفاعلات بين الهياكل قاتمة.
من أجل الكشف عن التفاعلات الخلوية بشكل لا لبس فيه بطريقة ديناميكية، هناك حاجة إلى تحسين درجة عالية القرار المكانية عميقة داخل الأنسجة. تقنيات nanoscopy قوية أدخلت حاليا على أساس خوارزميات عددية خاصة، مثل النهج بنية الإضاءة، على استنفاد أول دولة متحمس، على سبيل المثال </em> STED، RESOLFT، أو على توطين جزيء، مثل dSTORM، النخيل، وقد وجدت العديد من التطبيقات في خلايا ثابتة وكذلك في مزارع الخلايا الحية 7. ومع ذلك، من أجل توسيع نطاق هذه التطبيقات إلى أقسام الأنسجة، والأنسجة الحية والكائنات الحية ما زلنا بحاجة للتغلب على الصعوبات التقنية الشديدة. اثنين من الفوتون الإثارة STED مع أطوال موجية مختلفة وكذلك مع طول موجة واحدة (sw2PE-STED) عن الإثارة وحفز تم تطبيق القرار لتحسين الانبعاثات الجانبية في شرائح الدماغ 8 أو في مصفوفات اصطناعية مع خلايا جزءا لا يتجزأ من 9، على التوالي، في نفس القرار المحوري كما TPLSM القياسية. باستخدام فوتون واحد STED، يمكن تصوير ديناميات العمود الفقري شجيري على سطح القشرة الدماغية (تصل إلى 10-15 ميكرومتر العمق) في لقمة العيش Thy1 EGFP الماوس في قرار من 67 نانومتر 10. يتم توفير أداة مرنة للالبيولوجيا التطورية من متعدد البؤر المجهري منظم في الإضاءة، الذي يوفر تحسين شقين 2Dالقرار. ومع ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها فقط في الكائنات الحية مع الميل منخفضة من تشتت الضوء مثل أجنة سمك الزرد 11. لا يزال، فإن أيا من هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة نثر عالية من الحيوانات البالغة في عدة مئات من ميكرومتر، والتي هي نماذج حاسمة للبحوث الطبية الحيوية والسريرية للأمراض، مع ظهور بعد الولادة.
مستقلة عن التقريب المستخدمة لحساب موجة شكل الجبهة محدودة الحيود، أي وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية)، وبعد التركيز من خلال العدسة، والعرض من قوات الأمن الفلسطينية على طول المحور البصري (القرار المحوري) هو على الأقل ثلاث مرات أكبر من عرض PSF عمودي على المحور البصري (القرار الوحشي) 12. موجة التشوهات أمام أوامر مختلفة كميا بواسطة معامل Zernike في تعديل كبير على شكل موجة من الموجات الكهرومغناطيسية الجبهة تركيزا في مجال التصوير الأنسجة العميقة مما يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير PSFS، وخصوصا على طول البصريةمحور آل 13-15. وبالتالي، فإن القوانين حيود وآثار موجة التشويه أمامية على حد سواء تشير إلى قرار على طول المحور البصري كما العامل المحدد في التصوير الأنسجة العميقة. في حين أن التركيز على تقنيات nanoscopy مواجهة حدود الحيود فقط، هناك حاجة إلى التكنولوجيا مما يحسن القرار المحوري والتباين من خلال مواجهة كل من حيود والموجة الأمامية آثار التشويه عالية الدقة intravital التصوير. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هذا الأسلوب أيضا سريع بما يكفي للسماح رصد ديناميات الخلوية.
التصحيح في الوقت الحقيقي من الانحرافات قوات الأمن الفلسطينية وفقدان التباين باستخدام البصريات التكيفية في TPLSM وقد درس على نطاق واسع وتحسينها في العقد الماضي 13،14،16-18 وبالتالي فإنه هو أفضل الخيارات المتاحة حاليا مما يؤدي إلى إدارة أفضل للالإثارة الباليستية فوتونات الضوء 14. لا يزال، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم موجة التصحيح الأمامي النهج المستخدمة في البصريات التكيفية هي تكرارية وأنهم هكتارلقد لتكرارها لمناطق صغيرة (10 × 10 بضعة ميكرومتر 2) نظرا لعدم تجانس عالية من معامل الانكسار في الأنسجة، وسرعة اكتساب هو أقل بكثير مما هو ضروري لحركية الخلية التصوير والاتصالات. وعلاوة على ذلك، وتحسين الحد المادية في البصريات التكيفية-TPLSM لا يزال يحدده حيود.
التشكيل المكاني للإضاءة (SPIN) والتشكيل الزماني على الجانب الكشف (SPADE) وقد اقترحت نظريا ليتم تطبيقها على الليزر المجهر لتحسين القرار. التطبيق العملي في intravital التصوير ما زال يتعين تظاهر 19.
أخذت معا، وهناك طلب كبير على تطوير التكنولوجيات، التي من شأنها تحسين القرار لتصوير الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية الكبار. في هذا العمل، ونحن تحقيق التشكيل المكاني للنمط الإثارة عن طريق التحكم في عملية المسح متعددة الحزم في مخطط في الإضاءة متعدد الفوتون الليزر لياليتعليب المجهري (MB-SI-MPLSM) 20. خلافا للنهج منظم الإضاءة، حيث يتم التضمين قسم الإثارة شعاع عبر مكانيا، ونحن نستخدم فقط عملية المسح لتحقيق التشكيل المكاني للإثارة. من خلال توسيع الإثارة إلى الطول الموجي الأطول، ونحن قادرون على تحسين كل من القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في عمق الأنسجة من نثر للغاية الأنسجة (مثل العقدة الليمفاوية، نثر حرة مسار 47 ميكرومتر 6)، بصرف النظر عن بصري إشارة غير الخطية اكتشفنا، على سبيل المثال مضان، الجيل الثاني التوافقي أو تردد أخرى خلط الظاهرة. باستخدام هذا النهج في موجات الإثارة تصل إلى 900 نانومتر ونحن قادرون على حيوي صورة هياكل البروتين الخلوي على مقياس من جزيئات قليلة في مراكز جرثومي من الغدد الليمفاوية الماوس. وبالتالي، يمكننا تصور أفضل التفاعل بين وحدات المستضد تحمل على سطح الخلايا الجذعية الجريبي والخلايا B في عملية سبر المضادةجنرال خلال الاستجابة المناعية في الأجهزة اللمفاوية الثانوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهدف من التصوير الضوئي حيوي داخلي هو حيوي وظيفيا تصور الحركة الخلوية والتفاعلات من أجل فهم الأنسجة وظيفة الجهاز في الصحة والمرض 5. التكنولوجيا الأقوى لتحقيق ذلك، متعدد الفوتون الليزر المجهر، لا تزال لديه للتغلب على القيود المتعلقة موجة التشوهات الجبهة، نثر، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر R. Heintzmann لإجراء مناقشات مثمرة خلال تطوير نهج مخطط في الإضاءة، K. Rajewsky وA. هابرمان لتوفير C57BL / 6 B1-8 GFP الفئران المعدلة وراثيا. نعترف الألمانية للبحوث تحت منحة NI1167/3-1 (لRN)، وHA5354/4-1 SFB633، A15 مشروع (لAEH)، شاريتيه تحت منحة راحيل-هيرش الزمالة (لRN) للحصول على الدعم المالي. ونحن نعترف ولا سيما شبكة JIMI لإجراء مناقشات مثمرة ودعم البنية التحتية
Materials
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | – |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | – | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | – | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | – |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | – | – |
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | – | – |
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | – | – |
| water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany | – | – |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation – stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. . Advanced optical imaging. , (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
