Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse
Summary
PCR kombineret med høj opløsning smelte analyse (HRMA), er dokumenteret som en hurtig og effektiv metode til at genotype zebrafisk.
Abstract
Zebrafisk er en kraftfuld hvirveldyr modelsystem til at studere udvikling, modellering sygdom og udføre drug screening. For nylig en række genetiske værktøjer er blevet indført, herunder flere strategier til at inducere mutationer og generere transgene linier. Dog er storstilet screening begrænset af traditionelle genotypebestemmelse metoder, som er tidskrævende og arbejdskrævende. Her beskriver vi en teknik til at analysere zebrafisk genotyper ved PCR kombineret med høj opløsning smeltepunkt analyse (HRMA). Denne fremgangsmåde er hurtig, følsom og billig, med lavere risiko for artefakter forurening. Genotypebestemmelse ved PCR med HRMA kan anvendes til embryoner eller voksne fisk, herunder high-throughput screening protokoller.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er et hvirveldyr modelsystem vid udstrækning anvendes til undersøgelser af udvikling og sygdom modellering. For nylig er der blevet udviklet en lang række transgene og mutation teknologier til zebrafisk. Rapid transgenese teknikker, normalt er baseret på en Tol2 transposon system 1 er blevet kombineret med forbedrede kloning muligheder for flere DNA-fragment samling 2. Zinkfinger-nukleaser (ZFNs) og transskription aktivator-lignende effektor nucleaser (TALENS) er blevet anvendt til at målrette loci i både somatiske og germline celler i zebrafisk 3,4. Disse teknikker kan effektivt generere genmodificerede dyr, med høj frekvens mutation skabelse og kim-line transmission 3,4.
Trods disse fremskridt traditionelle genotypebestemmelse teknikker i zebrafisk begrænse den fulde effekt af de mutagenese og transgenese værktøjer. PCR efterfulgt af gelelektroforese, undertiden kombineret med restriction enzymfordøjelsen, er almindeligt anvendt til at detektere genom ændring, men er tidskrævende og mindre følsomme over for identificere små insertioner eller deletioner. TaqMan probeassays har høje startomkostninger og kræver omhyggelig optimering. Sekventering af PCR-produkter kan tage flere dage og er ikke praktisk for stor skala-screening. Restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP)-analyse kan kun skelne SNPs påvirker et begrænset udvalg af restriktionsenzymsteder genkendelsessites.
Høj opløsning smeltende analyse (HRMA), et lukket rør post-PCR-analyse metode, er en nyudviklet metode, der er hurtig, følsom, billig og medgørlige til screening af store antal prøver. HRMA kan anvendes til påvisning af SNP'er, mutationer og transgener 5-7. HRMA er baseret på termisk denaturering af dobbeltstrengede DNA'er, og hver PCR-amplikon har en unik dissociation (smelte) karakteristiske 5. Prøverne kan blive diskrimineret på grund af to deres forskellige nucleotid sammensætning, GC-indhold, eller længde, typisk i kombination med et fluorescerende farvestof, der kun binder dobbeltstrenget DNA 8. Således kan HRMA skelne mellem forskellige genotyper baseret på de forskellige smelte-kurve egenskaber. Fordi HRMA bruger billige reagenser og er et enkelt trin post-PCR-processen, kan det bruges til high-throughput strategier. HRMA er destruktiv, så følgende analyse PCR-amplikonerne kan bruges til andre formål. HRMA er blevet anvendt i mange organismer og systemer, herunder cellelinjer, mus og mennesker 9-11. Dens anvendelse er for nylig blevet beskrevet i zebrafisk til at opdage mutationer induceret af zink finger nucleaser (ZFNs) og Talens 6,12,13.
I dette papir, beskriver vi, hvordan du udfører PCR-baseret HRMA i embryonale og voksne zebrafisk (figur 1). Denne protokol er egnet til påvisning af SNP'er, transgenerne, og mutationer, herunder single basepar ændringer, indsættelser eller sletninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR kombineret med HRMA er en kraftfuld teknologi til zebrafisk genotypebestemmelse. Fordelene ved denne metode er dens hastighed, robusthed og følsomhed til at påvise selv punktmutationer. Hele protokollen, fra fin-clip at smelte-kurve analyse kan udføres på mindre end otte timer af en enkelt person. Hertil kommer, at teknikken er modtagelig for high-throughput screening ikke kræver anvendelse af ethidiumbromid, og er forseglet for alle PCR og analyse trin, som hjælper med at minimere forureningsproblemerne.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af Blaschke, Grunwald, og Wittwer Labs for rådgivning og teknisk assistance. Dette arbejde er støttet af PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 og DP2 MH100008, og March of Dimes Foundation forskningsbevilling # 1-FY13-425, til JLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
