Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse
Summary
PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) als schnelle und effiziente Methode, um Zebrafisch-Genotyp nachgewiesen.
Abstract
Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklung, Modellierung Krankheit und Arzneimittel-Screening durchführen. Kürzlich wurde eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen eingeführt, darunter mehrere Strategien zur Induktion von Mutationen und zur Erzeugung transgener Linien. Jedoch wird großen Screening durch Genotypisierung traditionellen Methoden, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind begrenzt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Zebrafisch-Genotypen durch PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) zu analysieren. Dieser Ansatz ist eine schnelle, empfindliche und preiswert, mit einem geringeren Risiko der Kontamination Artefakte. Genotypisierung mittels PCR mit HRMA für Embryonen oder ausgewachsene Fische verwendet werden, auch im Hochdurchsatz-Screening-Protokolle.
Introduction
Zebrafisch (Danio rerio), ein Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der weithin Entwicklung und Krankheit Modellierung verwendet. Kürzlich wurden zahlreiche transgenen und Mutationstechniken für Zebrafisch entwickelt. Rapid-Techniken Transgenese, in der Regel auf einem Tol2 Transposonsystem 1 basiert, haben mit verbesserten Klonen Optionen für mehrere DNA-Fragment Anordnung 2 zusammengefasst. Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) verwendet worden, um Loci in beiden somatischen und Keimbahnzellen im Zebrafisch 3,4 Ziel. Diese Techniken können effizient genetisch veränderte Tiere zu erzeugen, mit Hochfrequenz-Mutation Erstellung und Keimbahn-Übertragung 3,4.
Trotz dieser Fortschritte, traditionelle Techniken, Genotypisierung im Zebrafisch begrenzen die volle Leistung der Mutagenese und Transgenese-Tools. PCR, gefolgt von Gelelektrophorese, manchmal kombiniert mit EINSCHRÄNKn Enzymverdauung, wird häufig zur Modifikation Genom nachzuweisen, ist jedoch zeitaufwendig und weniger empfindlich gegenüber kleinen Insertionen oder Deletionen zu identifizieren. TaqMan-Sondentests haben eine hohe Anfangskosten und erfordern eine sorgfältige Optimierung. Die Sequenzierung von PCR-Produkten kann mehrere Tage dauern und ist nicht praktisch für große Screening. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse kann nur unterscheiden SNPs mit Auswirkungen auf eine begrenzte Anzahl von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen.
Hochauflösende Schmelzanalyse (HRMA), eine geschlossene Röhre Post-PCR-Analyseverfahren, ist eine kürzlich entwickelte Methode, die schnell, empfindlich, kostengünstig und zugänglich Screening einer großen Anzahl von Proben. HRMA kann verwendet werden, um SNPs, Mutationen und Transgene 5-7 zu erkennen. HRMA auf die thermische Denaturierung von doppelsträngigen DNAs basiert, und jedes PCR-Amplicon eine eindeutige Dissoziation (Schmelze) Kennlinie 5. Die Proben unterschieden werden durch to ihrer unterschiedlichen Nukleotid-Zusammensetzung, GC-Gehalt, oder Länge, in der Regel in Kombination mit einem Fluoreszenz-Farbstoff bindet, die nur doppelsträngige DNA-8. Somit kann HRMA verschiedenen Genotypen basierend auf den unterschiedlichen Schmelzkurvencharakteristika unterscheiden. Da HRMA verwendet Low-Cost-Reagenzien und ist eine Einzelschritt-Post-PCR-Verfahren, kann es für Hochdurchsatz-Strategien verwendet werden. HRMA ist nicht destruktiv, so dass folgende Analyse die PCR-Produkte auch für andere Anwendungen verwendet werden. HRMA in vielen Organismen und Systeme, einschließlich Zelllinien, Mäusen und Menschen 9-11 angewandt. Sein Einsatz hat kürzlich im Zebrafisch beschrieben worden, um Mutationen, die durch Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Talens 6,12,13 induziert wird.
In diesem Papier beschreiben wir, wie man auf PCR-Basis HRMA in embryonalen und adulten Zebrafisch (Abbildung 1) durchzuführen. Dieses Protokoll ist für die Detektion von SNPs, Transgene, und Mutationen, einschließlich single Basenpaar-Veränderungen, Insertionen oder Deletionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR in Kombination mit HRMA ist eine leistungsstarke Technologie für die Zebrafisch-Genotypisierung. Die Vorteile dieses Ansatzes sind seine Geschwindigkeit, Robustheit und Empfindlichkeit, auch Punktmutationen. Das gesamte Protokoll, aus fin-Clip zum Schmelzkurvenanalyse kann in weniger als acht Stunden von einer einzelnen Person durchgeführt werden. Darüber hinaus ist die Technik zugänglich für Hochdurchsatz-Screening, die Verwendung von Ethidiumbromid nicht erforderlich, und wird für alle PCR und Analyseschritt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder der Blaschke, Grunwald, Wittwer und Labors für die Beratung und technische Unterstützung. Diese Arbeit wird von der Stiftung PCMC, NIH R01 MH092256 und DP2 MH100008 und der March of Dimes Foundation Forschungsstipendium # 1-FY13-425, bis JLB unterstützt.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
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