उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण के साथ पीसीआर का उपयोग तेजी से और कुशल Zebrafish जीनोटाइपिंग
Summary
उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण (HRMA) के साथ संयुक्त पीसीआर zebrafish जीनोटाइप के लिए एक तेजी से और कुशल तरीके के रूप में प्रदर्शन किया है.
Abstract
Zebrafish, विकास का अध्ययन रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग के प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली हड्डीवाला मॉडल प्रणाली है. हाल ही में आनुवंशिक उपकरणों की एक किस्म म्यूटेशन उत्प्रेरण और ट्रांसजेनिक लाइनों पैदा करने के लिए कई रणनीतियों सहित, शुरू किया गया है. हालांकि, बड़े पैमाने पर प्रदर्शन समय लेने वाली और श्रम प्रधान हैं जो पारंपरिक जीनोटाइपिंग तरीकों, द्वारा सीमित है. यहाँ हम उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण (HRMA) के साथ संयुक्त पीसीआर द्वारा zebrafish जीनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक का वर्णन. यह दृष्टिकोण संदूषण कलाकृतियों के कम जोखिम के साथ, तेजी से, संवेदनशील, और सस्ती है. HRMA साथ पीसीआर द्वारा जीनोटाइपिंग उच्च throughput प्रदर्शन के प्रोटोकॉल में शामिल है, भ्रूण या वयस्क मछली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) व्यापक रूप से विकास और रोग मॉडलिंग के अध्ययन के लिए इस्तेमाल एक हड्डीवाला मॉडल प्रणाली है. हाल ही में, कई ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्तन प्रौद्योगिकियों zebrafish के लिए विकसित किया गया है. आमतौर पर एक Tol2 transposon प्रणाली 1 पर आधारित रैपिड transgenesis तकनीक, कई डीएनए टुकड़ा विधानसभा 2 में सुधार के लिए क्लोनिंग विकल्प के साथ संयुक्त कर दिया गया है. जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) zebrafish 3,4 में दोनों दैहिक और germline कोशिकाओं में loci लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन तकनीकों में कुशलता से उच्च आवृत्ति उत्परिवर्तन निर्माण और रोगाणु लाइन प्रसारण 3,4 के साथ, आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं उत्पन्न कर सकते हैं.
इन अग्रिमों के बावजूद, zebrafish में पारंपरिक जीनोटाइपिंग तकनीक mutagenesis और transgenesis उपकरणों की पूरी शक्ति की सीमा. पीसीआर कभी कभी restrictio के साथ संयुक्त, जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीछाn एंजाइम पाचन, व्यापक रूप से जीनोम संशोधन का पता लगाने के लिए किया जाता है, लेकिन समय लेने वाली और छोटे सम्मिलन या विलोपन की पहचान करने के लिए कम संवेदनशील है. TaqMan जांच assays के उच्च प्रारंभिक लागत है और सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है. पीसीआर उत्पादों का अनुक्रमण कई दिनों लेने के लिए और बड़े पैमाने पर प्रदर्शन के लिए व्यावहारिक नहीं है सकते हैं. प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) विश्लेषण केवल प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों की एक सीमित रेंज को प्रभावित करने SNPs भेदभाव कर सकते हैं.
उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण (HRMA), एक बंद ट्यूब बाद पीसीआर विश्लेषण विधि, तेजी से, संवेदनशील, सस्ती, और नमूनों की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है कि हाल ही में विकसित विधि है. HRMA SNPs, परिवर्तन, और transgenes 5-7 पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HRMA डबल असहाय DNAs की थर्मल विकृतीकरण पर आधारित है, और प्रत्येक पीसीआर amplicon विशेषता एक अनूठा हदबंदी (पिघल) 5 है. नमूने के कारण टी भेदभाव किया जा सकताहे उनके अलग न्यूक्लियोटाइड रचना, जीसी सामग्री, या लंबाई, आम तौर पर एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ संयोजन में केवल डबल असहाय डीएनए 8 बांधता है. इस प्रकार, HRMA अलग पिघल वक्र विशेषताओं के आधार पर अलग जीनोटाइप भेद कर सकते हैं. HRMA कम लागत अभिकर्मकों का उपयोग करता है और एक भी कदम के बाद पीसीआर प्रक्रिया है, क्योंकि यह उच्च throughput रणनीतियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HRMA तो विश्लेषण के बाद पीसीआर amplicons अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, nondestructive है. HRMA सेल लाइनों, चूहों, और मनुष्य 9-11 सहित कई जीवों और प्रणालियों, में लागू किया गया है. इसके प्रयोग हाल ही में जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और TALENS 6,12,13 से प्रेरित उत्परिवर्तन का पता लगाने के zebrafish में वर्णित किया गया है.
इस पत्र में, हम (चित्रा 1) भ्रूण और वयस्क zebrafish में पीसीआर आधारित HRMA प्रदर्शन करने के लिए क्या करते हैं. इस प्रोटोकॉल सी सहित SNPs, transgenes, और परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैngle आधार जोड़ी परिवर्तन, सम्मिलन, या विलोपन.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRMA साथ संयुक्त पीसीआर zebrafish जीनोटाइपिंग के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. इस दृष्टिकोण के लाभ इसकी गति, मजबूती, और यहां तक कि बिंदु उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता हैं. पूरे प्रोटोकॉल, पंख क्लिप …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सलाह और तकनीकी सहायता के लिए Blaschke, Grunwald, और Wittwer लैब्स के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम JLB को PCMC फाउंडेशन, एनआईएच R01 MH092256 और DP2 MH100008, और ऑफ डाइम्स फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान # 1 FY13-425 के मार्च, द्वारा समर्थित है.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
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