高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定
Summary
高解像度融解分析（HRMA）と合わせPCRは、ゼブラフィッシュの遺伝子型を決定するための迅速かつ効率的な方法として示されている。
Abstract
ゼブラフィッシュは、発達を研究する疾患をモデル化し、薬物スクリーニングを行うための強力な脊椎動物モデル系である。最近、遺伝のさまざまなツールが突然変異を誘発し、トランスジェニック系統を生成するための複数の戦略を含め、導入されている。しかしながら、大規模スクリーニングは、時間がかかり、労働集約的であり、伝統的な遺伝子型決定法によって制限される。ここでは、高分解能融解分析（HRMA）と組み合わせたPCRによるゼブラフィッシュの遺伝子型を分析するための技術が記載されている。このアプローチは、汚染の成果物のリスクが低いと、迅速、高感度、かつ安価である。 HRMAとPCRによる遺伝子型決定は、ハイスループットスクリーニングプロトコルを含めて、胚または成体の魚のために使用することができる。
Introduction
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が広く開発および疾患モデルの研究のために使用脊椎動物モデル系である。最近では、数々のトランスジェニック、突然変異の技術は、ゼブラフィッシュのために開発されている。通常、トランスポゾンシステム1に基づいた迅速な遺伝子導入技術は、複数のDNA断片の集合体2のための改良されたクローン作成オプションと組み合わされている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）は、ゼブラフィッシュの3,4の両方の体細胞および生殖細胞系列の細胞に遺伝子座を標的とするために使用されてきた。これらの技術は、効率的に高周波突然変異の作成 および生殖系列伝達3,4と、遺伝子改変動物を生成することができる。
これらの進歩にもかかわらず、ゼブラフィッシュの伝統的なジェノタイピング技術は、変異誘発および遺伝子導入ツールのフルパワーを制限している。 PCRは、時にはrestrictioと組み合わせ、ゲル電気泳動、続いてnは消化酵素、広くゲノム改変を検出するために使用されるが、小さな挿入または欠失を同定するための時間がかかり、あまり敏感である。 TaqManプローブアッセイは、高い初期コストが、慎重な最適化を必要とする。 PCR産物の配列決定は数日かかると大規模なスクリーニングには実用的ではないができる。制限断片長多型（RFLP）分析は、唯一の制限酵素認識部位の限られた範囲に影響を与えるSNPを識別することができる。
高解像度融解分析（HRMA）、閉じたチューブのポスト-PCR分析法は、迅速、高感度、安価で、かつ多数のサンプルをスクリーニングに適している最近開発された方法である。 HRMAのSNPは、突然変異、および5-7導入遺伝子を検出するために使用することができる。 HRMAは、二本鎖DNAの熱変性に基づくものであり、各PCRアンプリコンは、特徴的な固有の解離（溶湯）5を有している。サンプルは、tと判別することができるそれらの異なるヌクレオチド組成、GC含量、または長さが、O、通常、二本鎖DNA に結合する8蛍光色素と組み合わせて含む。従って、HRMAは、異なる溶融曲線の特性に基づいて、異なる遺伝子型を区別することができる。 HRMAは、低コストの試薬を使用し、シングルステップのポストPCR処理であるため、ハイスループット戦略のために使用することができる。 HRMAので分析後のPCRアンプリコンが他の用途に使用することができ、非破壊である。 HRMA、細胞株、マウス、およびヒト9-11を含む、多くの生物およびシステムに適用されている。その使用は、最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTALENS 6,12,13によって誘発される突然変異を検出するために、ゼブラフィッシュに記載されている。
本論文では、胚および成体ゼブラフィッシュ（ 図1）でPCRベースHRMAの実行方法について説明します。このプロトコルは、Siを含む、SNPは、導入遺伝子、および突然変異を検出するのに適しているngle塩基対の変化、挿入、または欠失。
Protocol
Representative Results
Discussion
HRMAと組み合わせたPCRは、ゼブラフィッシュの遺伝子型解析のための強力な技術です。このアプローチの利点は、その速度、ロバスト性、さらには点突然変異を検出するための感度である。全体のプロトコルは、フィンクリップする溶融曲線解析から、単一の個人によって8時間未満で行うことができる。また、この技術は、ハイスループットスクリーニングのために適している、臭化エチジ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、助言や技術支援のためのBlaschke、メイ、そしてウィトワーラボのメンバーに感謝。この作品は、JLBに、PCMC財団、NIH R01 MH092256とDP2 MH100008、そしてダイム財団研究助成金＃1-FY13-425の3月までサポートされています。
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
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