고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형
Summary
고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.
Abstract
제브라 피쉬는, 개발을 공부하는 질병을 모델링하고, 약물 검사를 수행하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 유전 도구의 다양한 돌연변이를 유도하고 유전자 변형 라인을 생성하기위한 여러 전략을 포함하여, 도입되었습니다. 그러나, 대규모 스크리닝은 시간 소모적이고 노동 집약적이다 전통적인 유전자형 방법에 의해 제한된다. 여기에서 우리는 고해상도 융점 분석 (르마)와 결합 PCR 기준 지브라 피쉬 유전자형을 분석하는 기술을 설명한다. 이 방법은 오염 유물의 낮은 위험과 함께, 빠른 민감하고 저렴합니다. 르마와 PCR에 의한 유전자형 높은 처리량 검사 프로토콜에 포함, 배아 또는 성인 물고기에 사용할 수 있습니다.
Introduction
제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 널리 개발 및 질병 모델링 연구에 사용되는 척추 동물 모델 시스템입니다. 최근 다수의 형질 전환 및 돌연변이 기술은 제브라 피쉬 위해 개발되었습니다. 일반적 Tol2 트랜스포존 시스템 (1)에 기초하여 피드 형질 전환 기술은, 다 DNA 단편 조립체이 향상된 복제 옵션과 결합되었다. 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)는 제브라 피쉬 3,4 모두 체세포와 생식 세포의 유전자 좌를 대상으로 사용되어왔다. 이 기술은 효율적으로 고주파 돌연변이 생성 및 세균 선 전송 3,4로, 유전자 변형 동물을 생성 할 수 있습니다.
이러한 발전에도 불구하고, 제브라 피쉬의 전통 유전자형 기술은 돌연변이 유발 및 형질 전환 도구의 모든 기능을 제한합니다. PCR은 때때로 restrictio 결합, 전기 영동 한 다음N 효소 소화가 널리 유전체 변형을 검출하기 위해 사용되지만, 시간 소모 및 작은 삽입 또는 삭제를 식별에 덜 민감하다. 의 TaqMan 프로브 분석은 높은 초기 비용을 가지고주의 최적화를 필요로합니다. PCR 제품의 시퀀싱은 며칠이 걸릴 대규모 검열을위한 실용적되지 않습니다 수 있습니다. 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석에만 제한 효소 인식 부위의 제한된 범위에 영향을주지의 SNP를 구별 할 수있다.
고해상도 녹는 분석 (르마), 폐 튜브 후 PCR 분석 방법은, 빠른 민감한, 저렴하고, 다수의 샘플을 심사하는 의무가 최근에 개발 된 방법이다. 르마는 SNP를, 돌연변이, 및 5-7 전이 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 르마는 이중 가닥의 DNA의 열 변성을 기준으로, 각각의 PCR 증폭 물이 특징 독특한 해리 (용융) 5을 가지고 있습니다. 샘플로 인해 T를 구별 할 수 있습니다O 서로 다른 염기 조성, GC 함량, 또는 길이는 일반적으로 형광 염료와 함께 만 이중 가닥 DNA (8)를 결합하는. 따라서, 르마는 다른 용융 곡선의 특성에 따라 서로 다른 유전자형을 구별 할 수 있습니다. 르마 저가의 시약을 사용하여 단일 단계 후 PCR 과정이므로, 높은 처리 전략을 위해 사용될 수있다. 르마 그래서 분석 다음 PCR 증폭 산물이 다른 애플리케이션에 사용될 수 있고, 비파괴이다. 르마 세포주, 마우스 및 인간 9-11 포함하여 많은 유기체 및 시스템에 적용되어왔다. 그것의 사용은 최근 징크 핑거 클레아 (ZFNs) 및 TALENs 6,12,13 의해 유도 돌연변이를 검출하기 위해 제브라 피쉬 설명되었다.
이 논문에서, 우리는 (그림 1) 배아와 성인 제브라 피쉬의 PCR 기반 르마을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은시를 포함하여, SNP를, 도입 유전자, 돌연변이를 검출하기에 적합하다ngle 기본 쌍 변경, 삽입, 또는 삭제.
Protocol
Representative Results
Discussion
르마와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형을위한 강력한 기술입니다. 이 방법의 장점은 그것의 속도, 신뢰성, 및 심지어 점 돌연변이를 검출 감도이다. 전체 프로토콜은, 지느러미 클립에 용융 곡선 분석에서, 한 개인에 의해 8 시간 이내에서 수행 할 수 있습니다. 또한, 기술은 높은 처리량 스크리닝 의무이다 티듐 브로마이드의 사용을 필요로하지 않으며, 오염 문제를 최소화 할 수있는 모든 PCR ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 조언과 기술 지원에 대한 Blaschke, Grunwald가, 그리고 비트 버 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 JLB에 PCMC 재단, NIH R01 MH092256와 DP2 MH100008, 그리고 천 재단 연구 보조금 # 1 – 2013 년 – 425 년 3 월에 의해 지원된다.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
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