Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis
Summary
PCR kombinert med høy oppløsning smelte analyse (HRMA) er vist som en rask og effektiv metode for å genotype sebrafisk.
Abstract
Sebrafisk er en kraftig virveldyr modellsystem for å studere utviklingen, modellering sykdom, og utfører medikamentscreening. Nylig ble en rekke genetiske verktøy er innført, inkludert flere strategier for å indusere mutasjoner og generering av transgene linjer. Imidlertid er store screening begrenset av tradisjonelle genotyping metoder, som er tidkrevende og arbeidskrevende. Her beskriver vi en teknikk for å analysere sebrafisk genotyper av PCR kombinert med høy oppløsning smelteanalyse (HRMA). Denne tilnærmingen er rask, følsom, og billig, med lavere risiko for forurensning gjenstander. Genotyping ved PCR med HRMA kan brukes for embryoer eller voksen fisk, blant annet i high-throughput screening protokoller.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) er et virveldyr modellsystem mye brukt for studier av utvikling og sykdom modellering. Nylig har mange transgene og mutasjons teknologier er utviklet for sebrafisk. Rapid transgenesis teknikker, som regel basert på en Tol2 transposon system 1, har blitt kombinert med forbedrede kloning alternativer for flere DNA fragment montering to. Sink-finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens) har blitt brukt til å målrette loci i både somatiske og germline celler i sebrafisk 3,4. Disse teknikkene kan effektivt generere genmodifiserte dyr, med høyfrekvente mutasjon etablering og bakterie-nettoverføring 3,4.
Til tross for disse fremskrittene, tradisjonelle genotyping teknikker i sebrafisk begrense full effekt av de mutagenese og transgenesis verktøy. PCR etterfulgt av gelelektroforese, noen ganger kombinert med restriction-enzymbehandling, er mye brukt for å detektere genom modifikasjon, men er tidkrevende og mindre følsom for å identifisere små innskudd eller delesjoner. TaqMan probe-analyser har høye initielle kostnader og krever forsiktig optimalisering. Sekvensering av PCR-produkter kan ta flere dager, og er ikke praktisk for storskala screening. Restriction fragment lengde polymorfisme (RFLP) analyse kan bare diskriminere SNPs som påvirker et begrenset utvalg av restriksjonsenzym anerkjennelse sider.
Høyoppløselig smelteanalyse (HRMA), et lukket rør post-PCR-analyse-metoden, er en nylig utviklet metode som er rask, sensitiv, billig og mottagelig for screening av store antall prøver. HRMA kan brukes til å oppdage SNPs, mutasjoner og transgener 5-7. HRMA er basert på termisk denaturering av dobbelt-strengede DNA-molekyler, og hvert PCR-fragment har en unik dissosiasjon (smelter) karakteristisk 5. Prøver kan bli diskriminert på grunn av to sin annen nukleotid-sammensetning, GC-innhold, eller lengde, typisk i kombinasjon med et fluorescerende fargestoff som bare binder dobbelttrådet DNA 8.. Således kan HRMA skille mellom forskjellige genotyper basert på de forskjellige smelte-kurvekarakteristikk. Fordi HRMA benytter rimelige reagenser og det er en enkelt-trinn-post-PCR-prosessen, kan den brukes for high-throughput strategier. HRMA er destruktiv, så følgende analyse PCR amplicons kan brukes til andre applikasjoner. HRMA har vært anvendt i mange organismer og systemer, inkludert cellelinjer, mus og mennesker 9-11. Bruken har nylig blitt beskrevet i sebrafisk til å oppdage mutasjoner indusert av sink finger nukleaser (ZFNs) og Talens 6,12,13.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan du utfører PCR-basert HRMA i embryonale og voksne sebrafisk (Figur 1). Denne protokollen er egnet til å påvise SNPs, transgener, og mutasjoner, inkludert single basepar endringer, innsettinger, eller slettinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR kombinert med HRMA er en kraftig teknologi for sebrafisk genotyping. Fordelene med denne fremgangsmåten er dens hastighet, robusthet, og følsomhet for å detektere og med punktmutasjoner. Hele protokoll, fra fin-klippet til smelte-kurve analyse kan utføres på mindre enn åtte timer av et enkelt individ. Dessuten er teknikken mottagelig for high-throughput screening, krever ikke bruk av etidiumbromid, og er forseglet til alle PCR-og analysefremgangsmåten, som bidrar til å redusere forurensningsproblemer.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Blaschke, Grunwald, og Wittwer laboratorier for råd og teknisk assistanse. Dette arbeidet støttes av PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 og DP2 MH100008, og March of Dimes Foundation forskningsstipend # 1-FY13-425, til JLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
