Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt
Summary
PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.
Abstract
Zebrafish é um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento, modelagem de doenças, e realizar a triagem de drogas. Recentemente, uma variedade de ferramentas genéticas foram introduzidas, incluindo várias estratégias para induzir mutações e gerar linhagens transgênicas. No entanto, o rastreio em larga escala é limitada pelos métodos de genotipagem tradicionais, que são consumidoras de tempo e de trabalho intensivo. Aqui nós descrevemos uma técnica para analisar genótipos zebrafish por PCR combinada com análise de alta resolução de fusão (HRMA). Esta abordagem é rápida, sensível e de baixo custo, com menor risco de artefatos de contaminação. A genotipagem por PCR com HRMA pode ser usado para embriões e peixes adultos, incluindo protocolos de triagem de alto rendimento.
Introduction
Peixe-zebra (Danio rerio) é um sistema de modelo animal vertebrado amplamente utilizado para estudos de desenvolvimento e modelagem de doenças. Recentemente, várias tecnologias transgênicas e mutação foram desenvolvidos para zebrafish. Técnicas de transgenia rápidos, geralmente com base em um sistema de transposon Tol2 1, foram combinados com melhores opções de clonagem para uma montagem múltipla fragmento de DNA 2. Nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores do tipo (TALENS) têm sido utilizadas para direccionar loci em ambas as células somáticas e germinais em peixes-zebra 3,4. Estas técnicas podem gerar de forma eficiente animais geneticamente modificados, com alta freqüência de criação e transmissão de mutação germinal 3,4.
Apesar destes avanços, técnicas de genotipagem tradicionais em zebrafish limitar o poder das ferramentas de mutagênese e transgenia. PCR, seguida por electroforese em gel, por vezes combinados com DISSEMINAÇdigestão enzimática n, é amplamente utilizado para detectar a modificação do genoma, mas é demorada e menos sensível à identificação de pequenas inserções ou deleções. Ensaios de sonda TaqMan têm altos custos iniciais e requerem otimização cuidadosa. A sequenciação de produtos de PCR pode levar vários dias e não é prática para a triagem em grande escala. Análise do polimorfismo de fragmentos de restrição (RFLP) só pode discriminar SNPs que afetam um número limitado de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição.
A análise de alta resolução de fusão (HRMA), um tubo fechado, o método de análise pós-PCR, é um método recentemente desenvolvido que é rápido, sensível, pouco dispendioso, e passíveis de rastreio de grandes números de amostras. HRMA pode ser utilizado para detectar SNPs, mutações e transgenes 5-7. HRMA é baseada em desnaturação térmica de ADN de cadeia dupla, e cada fragmento amplificado de PCR tem um único dissociação (derreter) característica 5. As amostras podem ser discriminados devido to a sua composição de nucleótidos diferente, teor de GC, ou comprimento, tipicamente em combinação com um corante fluorescente que se liga somente o ADN de cadeia dupla 8. Assim, HRMA pode distinguir diferentes genótipos com base nas diferentes características de fusão-curva. Porque HRMA utiliza reagentes de baixo custo e é um processo de pós-PCR de etapa única, que pode ser usado para as estratégias de alto rendimento. HRMA é não destrutiva, de modo que após a análise dos produtos de amplificação de PCR podem ser usados para outras aplicações. HRMA foi aplicado em muitos organismos e sistemas, incluindo linhas celulares, ratos e seres humanos 9-11. Seu uso foi recentemente descrito no peixe-zebra para detectar mutações induzidas por nucleases dedo de zinco (ZFNs) e Talens 6,12,13.
Neste artigo, descrevemos como executar HRMA baseado em PCR em zebrafish embrionárias e adultas (Figura 1). Este protocolo é adequado para a detecção de SNPs, os transgenes e mutações, incluindo simudanças ngle de pares de bases, inserções ou exclusões.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR combinada com HRMA é uma tecnologia poderosa para a genotipagem do peixe-zebra. As vantagens desta abordagem são a sua velocidade, robustez, e a sensibilidade para detectar mesmo mutações pontuais. O protocolo de todo, a partir de aleta-grampo análise para derreter-curva, pode ser realizada em menos de oito horas, por um único indivíduo. Além disso, a técnica é tratável através de rastreio de alto rendimento; não requer a utilização de brometo de etídio, e é selada por todas as etapas de PCR e de an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros das Blaschke, Grunwald, e Wittwer laboratórios para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho é apoiado pela Fundação PCMC, NIH R01 MH092256 e DP2 MH100008, ea Marcha de Dimes Foundation bolsa de investigação # 1-FY13-425, a JLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
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