Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución
Summary
PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.
Abstract
El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio del desarrollo, modelado de la enfermedad, y la realización de la detección de drogas. Recientemente se ha introducido una variedad de herramientas genéticas, incluyendo las múltiples estrategias para inducir mutaciones y la generación de líneas transgénicas. Sin embargo, el cribado a gran escala está limitada por los métodos de genotipificación tradicionales, que consumen mucho tiempo y mano de obra intensiva. Aquí se describe una técnica para analizar los genotipos de pez cebra mediante PCR en combinación con el análisis de alta resolución de fusión (HRMA). Este enfoque es rápido, sensible y de bajo costo, con menor riesgo de artefactos de contaminación. La genotipificación por PCR con HRMA se puede utilizar para los embriones o los peces adultos, incluidos en los protocolos de selección de alto rendimiento.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) es un sistema modelo de vertebrados ampliamente utilizada para estudios de desarrollo y modelado de la enfermedad. Recientemente, numerosas tecnologías transgénicas y de mutación se han desarrollado para el pez cebra. Técnicas de transgénesis rápida, generalmente basados en un sistema transposón Tol2 1, se han combinado con mejores opciones de clonación para el montaje fragmento de ADN múltiple 2. Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y de transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se han utilizado para dirigir los loci tanto en las células somáticas y de línea germinal en el pez cebra 3,4. Estas técnicas pueden generar eficientemente animales modificados genéticamente, con la creación de mutación de alta frecuencia y la transmisión de la línea germinal 3,4.
A pesar de estos avances, las técnicas de genotipado tradicionales en el pez cebra limitando la plena potencia de las herramientas de mutagénesis y transgénesis. PCR seguida de electroforesis en gel, a veces combinada con restriccioneN enzima de digestión, se utiliza ampliamente para detectar la modificación del genoma, pero consume tiempo y menos sensible para identificar pequeñas inserciones o deleciones. Ensayos con sondas TaqMan tienen altos costos iniciales y requieren una cuidadosa optimización. La secuenciación de los productos de la PCR puede tomar varios días y no es práctico para el cribado a gran escala. Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) sólo puede discriminar SNPs que afectan a una gama limitada de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.
Análisis de alta resolución de fusión (HRMA), un método de análisis post-PCR en tubo cerrado, es un método recientemente desarrollado que es rápido, sensible, de bajo costo, y es susceptible de análisis de gran número de muestras. HRMA se puede utilizar para detectar los SNPs, mutaciones, y los transgenes 5-7. HRMA está basado en la desnaturalización térmica de los ADN de doble cadena, y cada uno de amplificación de PCR tiene un único disociación (fundir) característica 5. Las muestras pueden ser discriminados por to su composición de nucleótidos diferente, contenido de GC, o longitud, típicamente en combinación con un colorante fluorescente que sólo se une de doble cadena de ADN 8. Por lo tanto, HRMA puede distinguir diferentes genotipos en base a las diferentes características en estado fundido de la curva. Debido a HRMA utiliza reactivos de bajo costo y es un proceso de post-PCR de un solo paso, que puede ser utilizado para las estrategias de alto rendimiento. HRMA es no destructivo, por lo siguiente análisis de los amplicones de PCR se pueden utilizar para otras aplicaciones. HRMA se ha aplicado en muchos organismos y sistemas, incluyendo líneas celulares, ratones y seres humanos 9-11. Su uso ha sido recientemente descrito en el pez cebra para detectar mutaciones inducidas por las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y talens 6,12,13.
En este trabajo se describe la forma de realizar HRMA PCR basada en el pez cebra embrionarias y adultas (Figura 1). Este protocolo es adecuado para la detección de SNPs, los transgenes, y mutaciones, incluyendo SINGLE cambios de pares de bases, inserciones o deleciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR combinada con HRMA es una tecnología de gran alcance para el genotipado de pez cebra. Las ventajas de este enfoque son su velocidad, robustez, y la sensibilidad para detectar incluso mutaciones puntuales. El protocolo de todo, desde el análisis hasta derretir curva fin-clip, se puede realizar en menos de ocho horas por un solo individuo. Además, la técnica es susceptible de cribado de alto rendimiento; no requiere el uso de bromuro de etidio, y se sella para todos PCR y pasos de análisis que ayuda a minimizar l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a los miembros de las Blaschke, Grunwald, y Wittwer laboratorios para el asesoramiento y la asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por la Fundación PCMC, NIH R01 MH092256 y DP2 MH100008, y la Fundación March of Dimes beca de investigación # 1-FY13-425, a JLB.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
