I denne video demonstrerer vi en protokol for dissektion af musens tværgående abdominismuskel og bruger immunfluorescens og mikroskopi til at visualisere neuromuskulære kryds.
Analyse af neuromuskulære junction morfologi kan give vigtig indsigt i den fysiologiske status af en given motor neuron. Analyse af tynde flade muskler kan give betydelige fordele i forhold til traditionelt anvendte tykkere muskler, såsom dem fra bagbenet(f.eks. gastrocnemius). Tynde muskler giver mulighed for omfattende overblik over hele innervation mønster for en given muskel, hvilket igen tillader identifikation af selektivt sårbare puljer af motoriske neuroner. Disse muskler tillader også analyse af parametre som motorisk enhedsstørrelse, axonal forgrening og terminal / nodal spiring. En almindelig hindring i at bruge sådanne muskler er at få den tekniske ekspertise til at dissekere dem. I denne video beskriver vi protokollen til dissekering af tværgående abdominis (TVA) muskel fra unge mus og udfører immunfluorescens for at visualisere axoner og neuromuskulære kryds (NMJs). Vi demonstrerer, at denne teknik giver et komplet overblik over TVA-musklens innerveringsmønster og kan bruges til at undersøge NMJ-patologi i en musemodel af barndommens motoriske neuronsygdom, spinal muskelatrofi.
Neuromuskulære vejkryds (NMJs) er den synaptiske forbindelse mellem en lavere motor neuron og en skeletmuskel fiber. De betragtes traditionelt som en trepartssynapse, der består af en neuron (præsynaptisk terminal), muskelfiber (postsynaptisk terminal) og terminal Schwann celle1. NMJs synes at være tidlige og betydelige mål i patologi i en række motoriske neuron sygdomme og mus modeller2,3. Typiske symptomer omfatter denervation, hvor motorens endplate bliver blottet for en præsynaptisk innervation, hævelse af den præsynaptiske terminal og en reduktion i kompleksiteten af NMJ morfologi4-11. Der kan også noteres kompenserende reaktioner, som omfatter terminal- og knudepunktspiring, hvor axonale processer strækker sig fra resterende synaptiske terminaler eller internoder til rekonserverede denerverede endeplader12,13. På grund af den tætte sammenhæng mellem synaptisk aktivitet og NMJ morfologi kan der opnås en masse information om motorneuronernes funktionelle status fra analyse af NMJ morfologi. Da tab af NMJs ofte repræsenterer et af de første aspekter af neuromuskulær patologi4,10, kan kvantificering på innervationsniveau give vigtige oplysninger om patologiens progression og den potentielle effekt af en terapeutisk intervention. Da NMJ-tab desuden udgør et betydeligt skridt i patologisk progression, kan udviklingen af terapeutiske, der kan stabilisere forbindelser og tilskynde til regenerering, give betydelige fordele.
Når man analyserer NMJ morfologi, er muskelvalg af stor betydning. Nogle af de primære overvejelser kan omfatte muskel fiber type, kropsstilling, og sammenlignende analyse til menneskelige forhold. Hertil kommer, at hvor manipulationer såsom injektion af stoffer eller traumatisk nerveskade er påkrævet, eksperimentel tilgængelighed er også vigtigt at overveje. Generelt er det at foretrække at analysere en række muskler placeret i hele kroppen afspejler en række motoriske enhed subtyper. Ofte er muskelvalg imidlertid påvirket af let dissektion. Derfor udføres NMJ-analyse ofte udelukkende på store blindtarmsmuskler som gastrocnemius. For at opnå god NMJ farvning i sådanne muskler, sektionsafbrydelse eller mekanisk forstyrrelse af muskelfibre er ofte påkrævet. Som følge heraf kan innervation mønster blive forstyrret og en omfattende og høj kvalitet analyse af innervation mønstre, spiring og denervation er ofte kompromitteret. En alternativ tilgang er at bruge tynde flade muskler, som ikke kræver sektionsopdeling og kan farves og monteres intakt, hvilket giver et omfattende overblik over hele innervation af musklen. Der er en række muskler, der kan bruges til en sådan analyse, herunder en gruppe af kraniale muskler, (omfatter levator auris longus, auricularis overlegen, og adductor auris longus)14, thorax muskler (f.eks. trekantede sterni) 15og mavemuskler(f.eks. tværgående abdominis (TVA)). Den største hindring i at bruge sådanne muskler er den tekniske ekspertise, der kræves for at dissekere dem uden skader.
I denne video giver vi en protokol til at dissekere og udføre immunfluorescerende mærkning af TVA-musklen fra musen for at muliggøre en omfattende analyse af innervation mønster og NMJ morfologi. TVA-musklen er en overvejende langsom rykmuskel, der består af det dybeste lag af abdominal muskulatur og er innerveret af de nedre intercostalnerver. Tidligere arbejde har vist, at det er konsekvent meget sårbar over for patologi i en række musemodeller af barndommen motor neuron sygdom spinal muskelatrofi (SMA) og i andre musemodeller af tidlig debut motor neuron degeneration4,16. Vi foreslår derfor, at TVA er en nyttig muskel til at foretage NMJ-analyse i perifere neuropatier.
I denne video har vi detaljeret en protokol for dissektion af TVA-musklen fra musen og for hele monteringen immunfluorescerende mærkning af NMJs i musklen. Vi præsenterer også data, der viser, at denne muskel kan bruges til at analysere neuromuskulær krydspatologi i en musemodel af SMA.
Succes i denne teknik er afhængig af en række faktorer. Nogle af de mest almindelige problemer er skitseret nedenfor. For det første: dårlig immunokemisk farvning. Der kan være en række årsager til dette, hvor en af de mest almindelige er brugen af forskellige reagenser end dem, der er anført i denne protokol. En høj kvalitet elektronmikroskopi kvalitet PFA er meget vigtigt at sikre god farvning, som er valget af antistoffer, der er anført i denne protokol. Derudover kan det være vanskeligere at få farvning af god kvalitet hos ældre dyr(dvs.> 3 måneder). Dette skyldes øget tykkelse af fascia omkring musklen og stigningen i fedtakkumulering mellem den eksterne skrå og tranversus abdominis. Det er vigtigt at fjerne fedtet, før du fortsætter til immunfluorescens. Det kan også være nødvendigt at fratage nogle af de fascia, der dækker musklen, som kan blive fortykket. Det er nogle gange svært at fratage fascia og fedt fra musklen uden at pådrage sig nogle skader på muskelfibre og en forstyrrelse af innervation mønster. Men hvis denne teknik udføres omhyggeligt, kan farvning af god kvalitet erhverves fra mus op til mindst 1 år. Hos yngre mus (dvs.mindre end 3 måneder) bør det ikke være nødvendigt at udføre nogen drilleri eller adskillelse af muskelfibre. For det andet: vanskeligt at finde NMJs efter dissektion og farvning. Dette skyldes ofte, at dissektionen ikke har strakt sig under det sidste ribben. Størstedelen af NMJs er placeret lige under det sidste ribben, og derfor skal man sørge for at sikre, at denne del af musklen er inkluderet i dissektionen. For det tredje: overholdelse af EO muskel til TVA muskel. Dette er ofte en klage, når enkeltpersoner forsøger at udvide dissektion under niveauet for den interne skrå (IO) muskel. Det område af TVA muskel, hvor IO er også til stede, er vanskeligere at analysere, da det kan være svært at skelne, hvilken muskel er der. Af denne grund dissekerer vi rutinemæssigt bare den mest overlegne del af TVA-musklen. På dette niveau er der ingen tilslutning mellem EO- og TVA-musklerne, og dette bør derfor ikke være et væsentligt problem.
En væsentlig hindring for at bruge TVA muskel, i forhold til blindtarmsmuskler, er tilgængelighed for enten kirurgiske manipulationer eller injektion af stoffer. Disse typer af eksperimenter kan være afgørende for at undersøge NMJ fysiologi i en given muskel. Selv om TVA er helt sikkert mindre let tilgængelige end mere almindeligt anvendte muskler såsom tibialis forreste eller gastrocnemius, tidligere arbejde har vist, at det er muligt at denervate TVA ved kirurgisk skade af intercostal nerver18. Vi har for nylig også brugt denne muskel til lokal administration af stoffer under fuld bedøvelse (ikke-offentliggjorte data). Selvom disse eksperimenter kan udgøre en moderat teknisk udfordring, viser dette arbejde, at de er mulige og dermed udvider nytten af denne muskel til analyse af NMJs under både patologisk og fysiologisk manipulation.
TVA muskel er en af en række tynde flade muskler placeret i hele kroppen, der kan bruges til hele mount analyse af innervation mønstre. Andre muskler omfatter en gruppe af kraniemuskler innerveret af motoriske neuroner stammer fra ansigtet kernen i hjernestammen, der omfatter levator auris longus, auricularis overlegen, og adductor auris longus, de dissektioner, som er blevet beskrevet tidligere14,19. Desuden kan muskulaturen omkring TVA-musklen, herunder EO, IO og rectus abdominis, også mærkes og bruges til NMJ-analyse. For omfattende analyse af NMJ patologi i en musemodel er det vigtigt at overveje en række muskler beliggende i hele kroppen og ikke at begrænse analysen til en enkelt muskel. Dette er eksemplificeret i musemodeller af motoriske neuronsygdomme, hvor der er betydelig heterogenitet i niveauer af NMJ patologi mellem forskellige muskler20. En sådan intermuskulær variation er et yderst værdifuldt værktøj, når man undersøger mekanismen for motorisk neuron sårbarhed og derfor begrænser analyse til en enkelt muskel kan betydeligt mindske potentialet i forskningen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra canadian Institutes of Health Research (grant number MOP 38040) til R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) til R.K., Families of SMA to R.K. and L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., and The Muscular Dystrophy Campaign to T.H.G.. L.M.M er modtager af en multipel sklerose Society of Canada Postdoctoral Fellowship, og RK er modtager af en University Health Research Chair fra University of Ottawa.
Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
Coverslips | Fisher | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |