इस वीडियो में हम माउस की ट्रांसवर्स एब्डोमिनिस मांसपेशी के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं और न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन आकृति विज्ञान का विश्लेषण किसी दिए गए मोटर न्यूरॉन की शारीरिक स्थिति में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि दे सकता है। पतली सपाट मांसपेशियों का विश्लेषण पारंपरिक रूप से उपयोग की जाने वाली मोटी मांसपेशियों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकता है, जैसे कि हिंद अंग(उदाहरण के लिए)से। गैस्ट्रोकनेमियस)। पतली मांसपेशियां किसी दिए गए मांसपेशियों के लिए पूरे इनरवेशन पैटर्न के व्यापक अवलोकन के लिए अनुमति देती हैं, जो बदले में मोटर न्यूरॉन्स के चुनिंदा कमजोर पूल की पहचान की अनुमति देती है। ये मांसपेशियां मोटर यूनिट साइज, एक्सोनल ब्रांचिंग और टर्मिनल/नोडल स्प्राउटिंग जैसे मापदंडों के विश्लेषण की भी अनुमति देती हैं । ऐसी मांसपेशियों का उपयोग करने में एक आम बाधा उन्हें विच्छेदन करने के लिए तकनीकी विशेषज्ञता प्राप्त कर रही है। इस वीडियो में, हम युवा चूहों से ट्रांसवर्स एब्डोमिनिस (टीवीए) मांसपेशी को विच्छेदन करने और एक्सोन और न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजेएस) की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह तकनीक टीवीए मांसपेशियों के इनरवेशन पैटर्न का पूरा अवलोकन देती है और बचपन की मोटर न्यूरॉन रोग, स्पाइनल मस्कुलर शोष के माउस मॉडल में एनएमजे विकृति की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक कम मोटर न्यूरॉन और कंकाल मांसपेशी फाइबर के बीच सिनैप्टिक कनेक्शन हैं। उन्हें पारंपरिक रूप से एक त्रिपक्षीय सिनैप्स माना जाता है, जो न्यूरॉन (प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल), मांसपेशी फाइबर (पोस्ट सिनैप्टिक टर्मिनल) और टर्मिनल श्वान सेल1से बना होता है। एनएमजेएस मोटर न्यूरॉन रोगों और माउस मॉडल2,3की एक श्रृंखला में पैथोलॉजी में जल्दी और महत्वपूर्ण लक्ष्य प्रतीत होते हैं। विशिष्ट लक्षणों में डिनेर्वेशन शामिल है, जहां मोटर एंडप्लेट एक प्रेसिनैप्टिक इनरवेशन, प्रेसिनैप्टिक टर्मिनल की सूजन, और एनएमजे आकृति विज्ञान4-11की जटिलता में कमी से रहित हो जाता है। प्रतिपूरक प्रतिक्रियाओं को भी नोट किया जा सकता है, जिसमें टर्मिनल और नोडल अंकुरण शामिल हैं, जहां अक्षीय प्रक्रियाएं शेष सिनैप्टिक टर्मिनलों या इंटरनोड से12,13को रेनरवेट्ड डीनरवेट्ड एंडप्लेट्स तक विस्तारित करती हैं। सिनैप्टिक गतिविधि और एनएमजे आकृति विज्ञान के बीच तंग सहसंबंध के कारण, एनएमजे आकृति विज्ञान के विश्लेषण से मोटर न्यूरॉन्स की कार्यात्मक स्थिति के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्राप्त किया जा सकता है। एनएमजेएस का नुकसान अक्सर न्यूरोमस्कुलर पैथोलॉजी4,10के पहले पहलुओं में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, इनरवेशन के स्तर पर मात्राकरण विकृति की प्रगति और चिकित्सीय हस्तक्षेप के संभावित प्रभाव के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी दे सकता है। इसके अलावा, एनएमजे हानि पैथोलॉजिकल प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है, चिकित्सा विज्ञान का विकास जो कनेक्शन को स्थिर कर सकता है और पुनर्जनन को प्रोत्साहित कर सकता है, महत्वपूर्ण लाभ प्राप्त कर सकता है।
एनएमजे आकृति विज्ञान का विश्लेषण करते समय, मांसपेशियों की पसंद का बहुत महत्व है। कुछ प्राथमिक विचारों में मांसपेशी फाइबर प्रकार, शरीर की स्थिति और मानव स्थितियों के लिए तुलनात्मक विश्लेषण शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, जहां पदार्थों के इंजेक्शन या दर्दनाक तंत्रिका चोट जैसे जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है, प्रयोगात्मक पहुंच पर भी विचार करना महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, मोटर इकाई उपप्रकारों की एक श्रृंखला को दर्शाती पूरे शरीर में तैनात मांसपेशियों की एक श्रृंखला का विश्लेषण करना बेहतर है। अक्सर, हालांकि, मांसपेशियों की पसंद विच्छेदन की आसानी से प्रभावित होती है। नतीजतन, एनएमजे विश्लेषण अक्सर विशेष रूप से गैस्ट्रोकनेमियसजैसी बड़ी परिशिष्ट मांसपेशियों पर किया जाता है। ऐसी मांसपेशियों में अच्छे एनएमजे धुंधला प्राप्त करने के लिए, मांसपेशियों के तंतुओं की अनुभागिंग या यांत्रिक व्यवधान अक्सर आवश्यक होती है। नतीजतन, इनरवेशन पैटर्न बाधित हो सकता है और इनरवेशन पैटर्न, अंकुरण और डीनर्वेशन के व्यापक और उच्च गुणवत्ता वाले विश्लेषण से अक्सर समझौता किया जाता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण पतली सपाट मांसपेशियों का उपयोग करना है जिन्हें खंडीकरण की आवश्यकता नहीं होती है और मांसपेशियों के पूरे इनरवेशन का व्यापक अवलोकन करने की अनुमति देता है, जिससे दाग और घुड़सवार बरकरार हो सकते हैं। ऐसी कई मांसपेशियां हैं जिनका उपयोग कपाल की मांसपेशियों के समूह सहित इस तरह के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, (लेवेटर ऑरिस लॉन्गस, ऑरिकुलेसिस श्रेष्ठ,और एडुकक्टर ऑरिस लांगस)14,वक्ष मांसपेशियां(उदाहरण के लिए)शामिल हैं। त्रिकोणीय ों की तासीर) 15,और पेट(जैसे ट्रांस बनाम एब्डोमिनिस (टीवीए)) मांसपेशियां। ऐसी मांसपेशियों का उपयोग करने में प्रमुख बाधा उन्हें नुकसान के बिना विच्छेदन करने के लिए आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता है।
इस वीडियो में, हम इनरवेशन पैटर्न और एनएमजे आकृति विज्ञान के व्यापक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए माउस से टीवीए मांसपेशी की इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग को विच्छेदन और प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। टीवीए मांसपेशी एक मुख्य रूप से धीमी चिकोटी मांसपेशी है जिसमें पेट की मांसपेशी की गहरी परत शामिल होती है और निचली इंटरकोस्टल नसों द्वारा आंतरिक होती है। पिछले काम ने इसे बचपन मोटर न्यूरॉन रोग स्पाइनल मस्कुलर शोष (SMA) के कई माउस मॉडलों में और शुरुआती शुरुआत मोटर न्यूरॉन डिजनरेशन4,16के अन्य माउस मॉडलों में विकृति के लिए लगातार अत्यधिक असुरक्षित दिखाया है। इसलिए हम सुझाव देते हैं कि टीवीए परिधीय न्यूरोपैथी में एनएमजे विश्लेषण शुरू करने के लिए एक उपयोगी मांसपेशी है।
इस वीडियो में, हम माउस से TVA मांसपेशी के विच्छेदन के लिए और मांसपेशियों के भीतर एनएमजेएस के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल विस्तृत है । हम इस मांसपेशी को दिखाने वाले डेटा को भी पेश करते हैं, इसका उपयोग एसएमए के माउस मॉडल में न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पैथोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
इस तकनीक में सफलता कई कारकों पर निर्भर है। कुछ सबसे आम समस्याओं को नीचे रेखांकित किया गया है। सबसे पहले: गरीब इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। इसके कई कारण हो सकते हैं, इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध लोगों के लिए विभिन्न अभिकर् ती का उपयोग सबसे आम है। एक उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड पीएफए अच्छा धुंधला सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी का विकल्प है। इसके अलावा, पुराने जानवरों(यानी> 3 महीने) में, अच्छी गुणवत्ता धुंधला होना अधिक कठिन हो सकता है। यह मांसपेशियों के आसपास के प्रावरणी की बढ़ी हुई मोटाई और बाहरी तिरछे और ट्रैन बनाम एब्डोमिनिस के बीच वसा संचय में वृद्धि के कारण है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए आगे बढ़ने से पहले वसा को पट्टी करना महत्वपूर्ण है। मांसपेशियों को कवर करने वाले कुछ प्रावरणी को बंद करना भी आवश्यक हो सकता है, जो गाढ़ा हो सकता है। मांसपेशियों के फाइबर को कुछ नुकसान पहुंचाए बिना मांसपेशियों से प्रावरणी और वसा को पट्टी करना मुश्किल होता है और आंतरिक पैटर्न में व्यवधान होता है। हालांकि अगर इस तकनीक को ध्यान से किया जाता है, तो चूहों से कम से कम 1 वर्ष तक अच्छी गुणवत्ता वाले धुंधला का अधिग्रहण किया जा सकता है। छोटे चूहों में(यानी3 महीने से कम उम्र) मांसपेशियों के तंतुओं के किसी भी चिढ़ाने या अलग करने के लिए आवश्यक नहीं होना चाहिए। दूसरे: विच्छेदन और धुंधला के बाद एनएमजे को खोजने में मुश्किल। ऐसा अक्सर इसलिए होता है क्योंकि विच्छेदन पिछले पसली के नीचे नहीं बढ़ाया गया है। एनएमजे के बहुमत सिर्फ पिछले पसली के नीचे स्थित है और इसलिए देखभाल के लिए मांसपेशियों के इस हिस्से को सुनिश्चित करने के विच्छेदन में शामिल किया जाना चाहिए । तीसरा: टीवीए पेशी के लिए ईओ की पेशी का पालन करना। यह अक्सर एक शिकायत होती है जब व्यक्ति आंतरिक तिरछे (आईओ) मांसपेशियों के स्तर से नीचे विच्छेदन का विस्तार करने का प्रयास करते हैं। टीवीए मांसपेशी का क्षेत्र जहां आईओ भी मौजूद है, विश्लेषण करना अधिक कठिन है क्योंकि यह अंतर करना मुश्किल हो सकता है कि कौन सी मांसपेशी है। इस कारण से, हम नियमित रूप से टीवीए मांसपेशियों का सबसे बेहतर हिस्सा विच्छेदन करते हैं। इस स्तर पर, ईओ और टीवीए मांसपेशियों के बीच कोई पालन नहीं है, और इसलिए यह एक महत्वपूर्ण समस्या नहीं होनी चाहिए।
परिशिष्ट मांसपेशियों की तुलना में टीवीए मांसपेशियों का उपयोग करने में एक महत्वपूर्ण बाधा, या तो सर्जिकल जोड़तोड़ या पदार्थों के इंजेक्शन के लिए पहुंच है। किसी दी गई मांसपेशियों में एनएमजे फिजियोलॉजी की जांच करने के लिए इस प्रकार के प्रयोग महत्वपूर्ण हो सकते हैं। यद्यपि टीवीए निश्चित रूप से टिबियालिस पूर्ववर्ती या गैस्ट्रोकनेमियसजैसी अधिक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली मांसपेशियों की तुलना में कम आसानी से सुलभ है , लेकिन पिछले कार्य से पता चला है कि इंटरकोस्टलनसोंकी सर्जिकल चोट से टीवीए को विकृत करना संभव है । हमने हाल ही में सामान्य संवेदनाहारी (अप्रकाशित डेटा) के तहत पदार्थों के स्थानीय प्रशासन के लिए इस मांसपेशी का भी उपयोग किया है। यद्यपि ये प्रयोग एक मध्यम तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, इस काम से पता चलता है कि वे व्यवहार्य हैं और इस प्रकार रोग और शारीरिक हेरफेर दोनों के तहत एनएमजेएस के विश्लेषण के लिए इस मांसपेशी की उपयोगिता का विस्तार करते हैं।
टीवीए मांसपेशी पूरे शरीर में स्थित कई पतली फ्लैट मांसपेशियों में से एक है जिसका उपयोग इनरवेशन पैटर्न के पूरे माउंट विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। अन्य मांसपेशियों में कपाल की मांसपेशियों का एक समूह शामिल है जो दिमाग तंत्र के चेहरे के नाभिक से निकलने वाले मोटर न्यूरॉन्स द्वारा आंतरिक रूप से, लेवेटर ऑरिस लॉन्गस, ऑरिकुलेसिस सुपीरियरऔर एडुकेटर ऑरिस लॉन्गस,विच्छेदन शामिल है जिसके लिए पहले14,19वर्णित किया गया है। इसके अलावा, ईओ, आईओ और रेक्टस एब्डोमिनिससहित टीवीए मांसपेशी के आसपास की मांसपेशी को भी एनएमजे विश्लेषण के लिए लेबल और उपयोग किया जा सकता है। माउस मॉडल में एनएमजे पैथोलॉजी के व्यापक विश्लेषण के लिए, पूरे शरीर में स्थित कई मांसपेशियों पर विचार करना महत्वपूर्ण है और विश्लेषण को एक भी मांसपेशियों तक सीमित नहीं करना महत्वपूर्ण है। यह मोटर न्यूरॉन रोगों के माउस मॉडल में उदाहरण है जहां विभिन्न मांसपेशियों के बीच एनएमजे विकृति के स्तर में महत्वपूर्ण विषमता है20. इस तरह के अंतरमस्कुलर परिवर्तनशीलता एक अत्यंत मूल्यवान उपकरण है जब मोटर न्यूरॉन भेद्यता के तंत्र की जांच और इसलिए एक ही मांसपेशी के लिए विश्लेषण सीमित काफी अनुसंधान की क्षमता कम हो सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (अनुदान संख्या एमओपी 38040) से आरके, मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन (यूएसए) से आरके, एसएमए के परिवारों को आरके और एल.M.M, एसटीएचजी को एसएमए ट्रस्ट और टीएचजी को मस्कुलर डिस्ट्रॉफी अभियान से अनुदान प्राप्त था। एल.M.M कनाडा पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप के एक मल्टीपल स्क्लेरोसिस सोसायटी के एक प्राप्तकर्ता है, और आरके ओटावा विश्वविद्यालय से एक विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य अनुसंधान कुर्सी के एक प्राप्तकर्ता है ।
Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
Coverslips | Fisher | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |