I denne videoen demonstrerer vi en protokoll for disseksjon av musens transversus abdominismuskel og bruker immunfluorescens og mikroskopi for å visualisere nevromuskulære veikryss.
Analyse av nevromuskulær koblingsmorfologi kan gi viktig innsikt i den fysiologiske statusen til en gitt motorisk nevron. Analyse av tynne flate muskler kan gi betydelig fordel i forhold til tradisjonelt brukte tykkere muskler, for eksempel de fra bakre lem (f.eks. gastrocnemius). Tynne muskler gir mulighet for omfattende oversikt over hele innervasjonsmønsteret for en gitt muskel, som igjen tillater identifisering av selektivt sårbare bassenger av motoriske nevroner. Disse musklene tillater også analyse av parametere som motorenhetsstørrelse, axonal forgrening og terminal / nodal spiring. Et vanlig hinder for å bruke slike muskler er å få den tekniske kompetansen til å dissekere dem. I denne videoen beskriver vi protokollen for dissekering av transversus abdominis (TVA) muskelen fra unge mus og utfører immunfluorescence for å visualisere aksoner og nevromuskulære veikryss (NMJs). Vi viser at denne teknikken gir en fullstendig oversikt over TVA-muskelens innerveringsmønster og kan brukes til å undersøke NMJ-patologi i en musemodell av barndomsmotorisk nevronsykdom, spinal muskelatrofi.
Nevromuskulære veikryss (NMJs) er den synaptiske forbindelsen mellom en lavere motorisk nevron og en skjelettmuskulaturfiber. De regnes tradisjonelt som en treparts synapse, bestående av en nevron (presynaptisk terminal), muskelfiber (postsynaptisk terminal) og terminal Schwann celle1. NMJs ser ut til å være tidlige og betydelige mål i patologi i en rekke motoriske nevronsykdommer og musemodeller2,3. Typiske symptomer inkluderer denervasjon, hvor motorens endeplate blir blottet for en presynaptisk innervering, hevelse i presynaptisk terminal og en reduksjon i kompleksiteten til NMJ-morfologien4-11. Kompenserende svar kan også bemerkes, som inkluderer terminal og nodal spiring, hvor axonal prosesser strekker seg fra gjenværende synaptiske terminaler eller internoder til reinnervated denervated endeplater12,13. På grunn av den tette sammenhengen mellom synaptisk aktivitet og NMJ-morfologi, kan man få mye informasjon om motoriske nevroners funksjonelle status fra analyse av NMJ morfologi. Som tap av NMJs representerer ofte et av de første aspektene ved nevromuskulær patologi4,10, kvantifisering på nivået av innervering kan gi viktig informasjon om progresjonen av patologi og den potensielle effekten av en terapeutisk inngrep. Videre, ettersom NMJ-tap representerer et betydelig skritt i patologisk progresjon, kan utviklingen av terapeutiske stoffer som kan stabilisere forbindelser og oppmuntre til regenerering gi betydelig fordel.
Når du analyserer NMJ morfologi, er muskelvalg av stor betydning. Noen av de viktigste hensynene kan omfatte muskelfibertype, kroppsposisjon og komparativ analyse av menneskelige forhold. I tillegg, hvor manipulasjoner som injeksjon av stoffer eller traumatisk nerveskade er nødvendig, er eksperimentell tilgjengelighet også viktig å vurdere. Generelt er det å foretrekke å analysere en rekke muskler plassert i hele kroppen som reflekterer en rekke motorenhetsundertyper. Ofte påvirkes imidlertid muskelvalget av enkel disseksjon. Følgelig utføres NMJ-analyse ofte utelukkende på store appendicular muskler som gastrocnemius. For å oppnå god NMJ-farging i slike muskler, er det ofte nødvendig med seksjonering eller mekanisk forstyrrelse av muskelfibre. Som et resultat kan innervasjonsmønsteret bli forstyrret, og en omfattende og høy kvalitet analyse av innervasjonsmønstre, spiring og denervasjon blir ofte kompromittert. En alternativ tilnærming er å bruke tynne flate muskler som ikke krever seksjonering og kan farges og monteres intakt, slik at en omfattende oversikt over hele innervering av muskelen. Det finnes en rekke muskler som kan brukes til en slik analyse, inkludert en gruppe kranialmuskler, (som omfatter levator auris longus, auricularis superior, og adductor auris longus)14, thoracic muskler (f.eks. triangularis sterni) 15og magemuskler(f.eks. transversus abdominis (TVA)). Den største hindringen for å bruke slike muskler er den tekniske kompetansen som kreves for å dissekere dem uten skade.
I denne videoen gir vi en protokoll for å dissekere og utføre immunfluorescerende merking av TVA-muskelen fra musen for å tillate en omfattende analyse av innervasjonsmønster og NMJ-morfologi. TVA-muskelen er en overveiende langsom rykningsmuskel som består av det dypeste laget av abdominal muskulatur og er innervert av de nedre intercostal nervene. Tidligere arbeid har vist at det er konsekvent svært sårbart for patologi i en rekke musemodeller av barndommen motorisk nevronsykdom spinal muskelatrofi (SMA) og i andre musemodeller av tidlig startmotor neuron degenerasjon4,16. Vi foreslår derfor at TVA er en nyttig muskel for å gjennomføre NMJ-analyse i perifere nevropatier.
I denne videoen har vi detaljert en protokoll for disseksjonen av TVA-muskelen fra musen og for helmontert immunfluorescerende merking av NMJs i muskelen. Vi presenterer også data som viser at denne muskelen kan brukes til å analysere nevromuskulær koblingspatologi i en musemodell av SMA.
Suksess i denne teknikken er avhengig av en rekke faktorer. Noen av de vanligste problemene er skissert nedenfor. For det første: dårlig immunhiistokjemisk farging. Det kan være en rekke årsaker til dette, en av de vanligste er bruk av forskjellige reagenser til de som er oppført i denne protokollen. En høykvalitets elektronmikroskopi klasse PFA er svært viktig for å sikre god farging, som er valget av antistoffer oppført i denne protokollen. I tillegg, hos eldre dyr (dvs.> 3 måneder), kan det være vanskeligere å få farging av god kvalitet. Dette er på grunn av økt tykkelse på fascia rundt muskelen og økningen i fettakkumulering mellom ytre skrå og tranversus abdominis. Det er viktig å fjerne fettet, før du fortsetter til immunfluorescens. Det kan også være nødvendig å fjerne noe av fascia som dekker muskelen, som kan bli tykkere. Det er noen ganger vanskelig å fjerne fascia og fett fra muskelen uten å pådra seg noen skade på muskelfiberen og en forstyrrelse av innervasjonsmønsteret. Men hvis denne teknikken utføres nøye, kan farging av god kvalitet anskaffes fra mus opp til minst 1 år. Hos yngre mus (dvs.mindre enn 3 måneder) bør det ikke være nødvendig å utføre erting eller separasjon av muskelfibre. For det andre: vanskelig å finne NMJs etter disseksjon og farging. Dette skyldes ofte at disseksjonen ikke har strakte seg under den siste ribben. De fleste NMJs ligger like under den siste ribben og derfor må det tas hensyn til at denne delen av muskelen er inkludert i disseksjonen. For det tredje: Overholdelse av EO-muskelen til TVA-muskelen. Dette er ofte en klage når enkeltpersoner forsøker å forlenge disseksjonen under nivået av den indre skrå (IO) muskelen. Området av TVA muskelen der IO er også til stede er vanskeligere å analysere som det kan være vanskelig å skille hvilken muskel er hvilken. Av denne grunn dissekerer vi rutinemessig bare den mest overlegne delen av TVA-muskelen. På dette nivået er det ingen overholdelse mellom EO- og TVA-musklene, og derfor bør dette ikke være et betydelig problem.
En betydelig hindring for å bruke TVA-muskelen, sammenlignet med appendicular muskler, er tilgjengelighet for enten kirurgiske manipulasjoner eller injeksjon av stoffer. Denne typen eksperimenter kan være avgjørende for å undersøke NMJ fysiologi i en gitt muskel. Selv om TVA absolutt er mindre lett tilgjengelig enn mer brukte muskler som tibialis fremre eller gastrocnemius, tidligere arbeid har vist at det er mulig å denervate TVA ved kirurgisk skade på intercostal nerver18. Vi har nylig også brukt denne muskelen for lokal administrering av stoffer under generell bedøvelse (upubliserte data). Selv om disse eksperimentene kan representere en moderat teknisk utfordring, viser dette arbeidet at de er gjennomførbare og dermed utvider nytten av denne muskelen for analyse av NMJs under både patologisk og fysiologisk manipulasjon.
TVA-muskelen er en av en rekke tynne flate muskler som ligger i hele kroppen som kan brukes til helmontert analyse av innervasjonsmønstre. Andre muskler inkluderer en gruppe kraniale muskler innervated av motoriske nevroner som stammer fra ansiktskjernen i hjernestammen, som omfatter levator auris longus, auricularis superior, og adductor auris longus, disseksjonene som har blitt beskrevet tidligere14,19. Videre kan muskulaturen rundt TVA-muskelen, inkludert EO, IO og rectus abdominis, også merkes og brukes til NMJ-analyse. For omfattende analyse av NMJ-patologi i en musemodell, er det viktig å vurdere en rekke muskler som ligger i hele kroppen og ikke å begrense analysen til en enkelt muskel. Dette er eksemplifisert i musemodeller av motoriske nevronsykdommer der det er betydelig heterogenitet i nivåer av NMJ-patologi mellom forskjellige muskler20. Slike intermuskulære variasjoner er et ekstremt verdifullt verktøy når man undersøker mekanismen for motorisk nevronsårbarhet, og derfor kan begrensning av analyse til en enkelt muskel redusere potensialet i forskningen betydelig.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Canadian Institutes of Health Research (tilskuddsnummer MOP 38040) til R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) til R.K., Families of SMA til R.K. og L.M.M, SMA Trust til T.H.G., og The Muscular Dystrophy Campaign til T.H.G.. L.M.M er mottaker av Multiple Sclerosis Society of Canada Postdoctoral Fellowship, og R.K. er mottaker av en universitetshelseforskningsleder fra Universitetet i Ottawa.
Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
Coverslips | Fisher | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |