Analyse af translationsinitieringskodon under stress betingelser ved Polysomprofiler Profiling
Summary
Her beskriver vi en metode til at analysere ændringer i initiering af mRNA-translation af eukaryote celler som reaktion på stress-tilstande. Denne metode er baseret på hastigheden separation på saccharosegradienter med oversættelse ribosomer fra ikke-translating ribosomer.
Abstract
Præcis styring af mRNA-translation er grundlæggende for eukaryot celle-homeostase, især som reaktion på fysiologisk og patologisk stress. Ændringer i dette program kan føre til vækst i beskadigede celler, kendetegnende for udvikling af cancer, eller for tidlig celledød som ses i neurodegenerative sygdomme. Meget af hvad der er kendt om den molekylære basis for translationel er opnået kontrol fra polysom analyse ved hjælp af en densitetsgradient fraktionering system. Denne teknik er baseret på ultracentrifugering af cytoplasmatiske ekstrakter på en lineær saccharosegradient. Når spin er afsluttet, giver systemet mulighed for fraktionering og kvantificering af centrifugerede zoner svarende til forskellige oversætte ribosomer befolkninger, hvilket resulterer i en polysom profil. Ændringer i polysom profil er tegn på ændringer eller mangler i translationsinitiering, der opstår som reaktion på forskellige former for stress. Denne teknik gør det også muligt at vurdere the betydningen af specifikke proteiner på translationsinitiation og måle translationel aktivitet af specifikke mRNA'er. Her beskriver vi vores protokol til at udføre polysom profiler for at vurdere translationsinitiering af eukaryote celler og væv under enten normale eller stress vækstbetingelser.
Introduction
Eukaryote celler konstant støder på en række skadelige fysiologiske og miljømæssige stress forhold, der kræver en hurtig adaptiv celle respons. Cell stress respons involverer en præcis balance mellem anti-overlevelse og pro-overlevelse handler faktorer. Forstyrre denne balance kan have uoprettelige konsekvenser, der fører til udvikling af humane patologier såsom cancer og neurodegenerative sygdomme. Under det første trin af stress respons, aktivere celler pro-overlevelse veje, der involverer koordineret kontrol af ændringer i genekspression på niveauet af mRNA translation.
mRNA translation i eukaryoter er en kompleks cellulær proces, der involverer koordinerede samspil mellem translationsinitieringsregioner faktorer (EIFS), specifik RNA-bindende proteiner (RBDS) og RNA-molekyler 1. mRNA oversættelse er inddelt i tre særskilte faser: initiering, elongering og terminering. Selvom alle tre faser er underlagt reguleringlatory mekanismer translationelle kontrolmekanismer målrettet meste initieringsfasen oversættelse, som således udgør den hastighedsbegrænsende trin af proteinsyntese. 2.
Oversættelse indvielse er en meget ordnet proces, der begynder med dannelsen af eIF2a.GTP.Met-tRNA jeg mødte ternære kompleks og den efterfølgende binding til 40S ribosom subunit, der fører til dannelsen af komplekset præ-indvielse. Det næste skridt er rekruttering af preinitiation kompleks til mRNA, som involverer aktiviteten af translationsinitieringsregioner faktorer såsom eIF4F og eIF3. Den således dannede 48S preinitiation kompleks gennemgår specifikke konformationsændringer der muliggør dette maskineri til at begynde at scanne 5'-utranslaterede region af mRNA, indtil den anerkender initieringskodonet august De fleste af de translationsinitieringsregioner faktorer er derefter frigivet og 60S-subunits er rekrutteret til at danne en 80S ribosomkomplekset kompetent til oversættelsen ent hvilket punkt Proteinsyntese starter (Figur 1). Mere end én 80S monosome kan oversætte den samme mRNA på et tidspunkt producerer såkaldte polysomer (eller polyribosomer). Tætheden af polysomer på et mRNA afspejler den indvielse, strækning og termineringspriser, og dermed er et mål for oversættelighed af en bestemt udskrift. Imidlertid er polysom profil hovedsageligt bruges til at vurdere ændringer i mRNA translation ved trin indledningen. Her har vi brugt en proteasominhibitor som translationsinitiering inhibitor. Behandling af cancerceller med dette stof inducerer en stress-respons er karakteriseret ved aktivering af stress kinase kaldet HRI som phosphorylerer translationsinitiering faktor eIF2a 3. Phosphorylering af eIF2a er en af de store begivenheder, der fører til hæmning af translationsinitiation i pattedyrceller 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den polysom profil analyse på sucrosegradienter tillader måling af translationsinitiering ved at analysere tætheden af polysomer isoleret fra celler eller væv 9,11-14. Denne teknik er den bedste (hvis ikke den unikke) til at måle translationsinitiering in vivo. Det bruges til at overvåge translationel status voksende celler under cellecyklus 15, og for at vurdere effekten af forskellige typer af stress, herunder virusinfektioner, hypoxi 13,16, stråling 17,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA er en modtager af et stipendium "Pierre Durand" fra fakultetet for medicin Laval University. Dette arbejde blev støttet af naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (MOP-CG095386) til RM polysom fraktionator blev erhvervet gennem et canadisk Foundation for innovation tilskud (MOP-GF091050) til RMR M besidder en ny CIHR pris investigator løn.
Vi er taknemmelige for Drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di Marco og A. Cammas for nyttige råd.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
References
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. 암 연구학. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
