Streptococcus pneumoniae er den førende patogen forårsager alvorlige community-erhvervet pneumoni og ansvarlig for over 2 millioner dødsfald på verdensplan. Kan følges op på virkningen af bakterielle faktorer impliceret i fitness eller virulens i realtid i en akut mus lungebetændelse eller bakteriæmi model ved hjælp af selvlysende bakterier.
Lungebetændelse er en af de store sundhedsvæsenets problemer i udviklingslandene og de industrialiserede lande og er forbundet med betydelig sygelighed og dødelighed. Trods fremskridt i viden om denne sygdom, tilgængeligheden af intensivafdelinger (ICU), og brugen af potente antimikrobielle stoffer og effektive vacciner, dødeligheden fortsat høje 1.. Streptococcus pneumoniae er den førende patogen af community-erhvervet pneumoni (CAP) og en af de mest almindelige årsager til bakteriæmi hos mennesker. Dette patogen er udstyret med en udrustning af overflade-eksponerede adhæsinerne og virulens faktorer, der bidrager til lungebetændelse og invasiv pneumokoksygdom (IPS). Vurderingen af in vivo rollen af bakterielle fitness eller virulensfaktorer er af allerstørste betydning at trævle S. pneumoniae patogenicitet mekanismer. Murine modeller af lungebetændelse, bakteriæmi og meningitis bliver brugt til at fastslå virkningen af pneumokok-faktorer ved difskellige faser af infektionen. Her beskriver vi en protokol til at overvåge i realtid pneumokok udbredelse i mus efter intranasal eller intraperitoneal infektioner med selvlysende bakterier. Resultaterne viser formering og spredning af pneumokokker i de nedre luftveje og blod, som kan visualiseres og evalueres ved hjælp af et billedbehandlingssystem og den ledsagende analyse software.
Luftvejsinfektioner forårsaget af virus eller bakterier er fortsat en af de mest almindelige samfunds-erhvervet eller kliniske problemer på verdensplan forårsager cirka en tredjedel af alle dødsfald på verdensplan. De vigtigste bakteriearter er Haemophilus influenzae og Streptococcus pneumoniae 2. Men disse bakteriearter er normalt fælles bestanddele af den naturlige luftveje flora. Således bakteriel vogn er også vis risiko for invasiv sygdom og afhængig af immunstatus eller forfordele af enkeltpersoner. Den asymptomatisk kolonisering udløses til invasive infektioner. Streptococcus pneumoniae er den førende patogen af community-erhvervet pneumoni (CAP) og en af de mest almindelige årsager til bakteriæmi hos mennesker. Hos raske individer S. pneumoniae (pneumokokker) er ofte asymptomatiske og harmløse kolonisatorer i de øvre luftveje, hvor de konfronteres med nonpathogenic bakterieraf de bosiddende flora, men også med patogener, såsom Haemophilus spp. eller Staphylococcus aureus og den første linje af det menneskelige immunforsvar. Carriage er højest i små børn (37%) og endnu højere i overfyldte daginstitutioner (58%) 3-5. Den yngste befolkning og de ældre, der modtager pneumokokker via aerosol transmission fra luftfartsselskaber og nasopharynx sekreter 6, hører til de højrisikogrupper og vaccination ved hjælp af en af de pneumokok konjugerede vacciner (PCV10 eller PCV13 hos børn og 23-valent polysaccharid PPSV23 hos voksne) anbefales i USA (US) og mange europæiske lande 4. Den PPSV23 dækker serotyper, der er ansvarlige for ~ 90% af de bakteriæmiske pneumokok-sygdomme i USA og Europa, som forhindrer dermed effektivt invasiv pneumokoksygdom sygdomme (IPD) hos voksne, mens PCVs dækker de mest udbredte serotyper i børn. Følgelig IPD grund af vaccine typer (VT) er reducerede men nonvaccine serotyper viser en høj virulens potentiale og antibiotikaresistens er dukket 4,7-12. Nasopharynx som reservoiret er udgangspunktet for pneumokokker at sprede sig til bihulerne eller midterste ører initierende skadelige lokale infektioner. Mere vigtigt, pneumokokker spredes direkte via luftvejene til bronkierne og lungerne resulterer i livstruende CAP 4,13. Lungeinfektioner er ofte ledsaget med væv og ødelæggelse barriere, således at patogenet spredes i blodet og forårsager IPD. Forekomsten af den fælles landbrugspolitik og IPD er højest i immunsvækkede personer eller i de yderste områder af alder 4,13. De omstændigheder, der er ansvarlige for omdannelsen fra en commensal for et patogen med høj virulens er stadig under debat. Imidlertid har foruden ændringer i host modtagelighed og evolutionær tilpasning ledsaget med højere virulens og stigningen i antibiotikaresistenser blevet foreslået at have en afgørende indflydelse på PNEumococcal infektioner 14-16.
Patogenet er udstyret med en flerhed af adhæsiner, der medierer intim kontakt til mukosale epitelceller. Efter overvindelsen af den luftvejs slim, er pneumokok vedhæftning til værtsceller lettes via direkte interaktioner af overfladeeksponerede adhesiner med cellulære receptorer og ved at udnytte ekstracellulære matrix komponenter eller serumproteiner som bro molekyler 4,17,18. Som alsidige patogener pneumokoktyper er også udstyret med faktorer involveret i unddragelse af værtens immun forsvarsmekanismer. Desuden har de evnen til at tilpasse til forskellige host miljøer såsom lunge, blod og cerebrospinalvæske (CSF), henholdsvis 5,17,19,20.
Virkningen af bakterielle faktorer patogenese og inflammatoriske værtsresponser er undersøgt i eksperimentelle dyremodeller for lungebetændelse, bakteriæmi eller meningitis 21-25. Trods et humant patogen, disse modeller er vill-etableret for at dechifrere pneumokok væv tropisme, virulens mekanismer eller protectivity af pneumokokvaccine kandidater. Den genetiske baggrund af indavlede musestammer bestemmer modtagelighed for pneumokokker. BALB / c-mus intranasalt inficeret med pneumokokker blev fundet at være resistente, mens CBA / Ca-og SJL-mus var mere modtagelige over for pneumokokinfektioner 22. Dette indebærer, at ligner mennesker, den genetiske baggrund og værtsforsvarsmekanismer bestemme udfaldet af infektionen. Derfor er det nødvendigt at opklare modstand loci i genomet af mus mindre modtagelige for pneumokokinfektioner yderligere indsats. Resultaterne har ført til ændringer i in vivo virulens protokoller. I stedet for de indavlede BALB / c mus, der ofte anvendes i fortiden, er de meget modtagelige CD-1/MF1 udavlede musestammer dag ofte bruges til at undersøge effekten af tab af funktion pneumokok virulens eller fitness faktorer 26-28. Desuden er tilgængelighedenaf bioluminescerende pneumokokker og optiske billeddannende teknikker tillader tidstro bioluminescens Bioimaging infektioner. I pneumokokker er indsat den optimerede luxABCDE genkassette (plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km R) i en enkelt integration stedet for kromosomet ved transposon mutagenese. Bioluminiscerende pneumokokker er blevet anvendt til at vurdere dæmpningen af pneumokok mutanter med mangelfuld virulens eller fitness faktorer og deres translokation fra en anatomisk websted til et andet 26,28-31.
Her giver vi en protokol for bioimaging af pneumokok infektioner i en murin lungebetændelse eller sepsis model. Forstærkning og formidling af bioluminiscerende pneumokokker i intranasalt eller intraperitonealt inficerede mus kan nemt overvåges over tid ved hjælp af et optisk imaging system, og det samme dyr på forskellige tidspunkter.
Alle eksperimenter udført i dyr skal godkendes af de lokale myndigheder og etik provisioner. I in vivo infektion eksperimenter den bakterielle belastning i de forskellige host nicher af inficerede dyr skal bestemmes på forskellige tidspunkter efter infektion. Under disse eksperimentelle forhold har de dyr, der skal ofres, før isolering af bakterier fra blodet, nasopharynx, bronchoalvelar udskylning, eller organer såsom lunger, milt og hjerne. For at beregne antallet af bakterier pr vært niche og vurd…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i laboratoriet blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) og Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF) Medicinsk Infektion Genomics (FKZ 0315828A) til SH.
Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
Equipment | |||
Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |