После в режиме реального времени Влияние пневмококковой факторов вирулентности в острой Mouse пневмонии Модель Использование биолюминесцентных бактерии
Summary
Пневмококк является ведущим возбудителем тяжелой внебольничной пневмонии и отвечает за более чем 2 миллиона смертей во всем мире. Влияние бактериальных факторов, вовлеченных в фитнес или вирулентности можно отслеживать в режиме реального времени в острой мыши пневмонии или бактериемия модели с использованием биолюминесцентных бактерии.
Abstract
Пневмония является одной из основных проблем здравоохранения в развивающихся и промышленно развитых странах и связана со значительным заболеваемости и смертности. Несмотря на успехи в знании этой болезни, наличия отделениях интенсивной терапии (ОИТ), а также использование сильнодействующих противомикробных препаратов и эффективных вакцин, показатели смертности остаются высокими 1. Пневмококк является ведущим возбудителем внебольничной пневмонии (ВП) и одним из наиболее распространенных причин бактериемии у людей. Это возбудитель оснащен арсенал поверхностно-подвергается адгезинов и вирулентности факторов, способствующих пневмонии и инвазивных пневмококковых инфекций (IPD). Оценка роли в естественных бактериальных фитнес или факторов вирулентности имеет первостепенное значение, чтобы разгадать S. пневмонии патогенности механизмов. Мышиные модели пневмонии, бактериемии и менингита используются для определения влияния пневмококковых факторов при разразличных стадиях инфекции. Здесь мы опишем протокол для мониторинга в режиме реального времени пневмококковой распространения у мышей после интраназального или внутрибрюшинными инфекций с биолюминесцентных бактерий. Результаты показывают, умножение и распространение пневмококков в нижних дыхательных путей и крови, что может быть визуально и оценивали с помощью системы визуализации и программное обеспечение прилагаемого анализа.
Introduction
Инфекции дыхательных путей, вызванных вирусами или бактериями остаются одним из наиболее распространенных внебольничных или клинических проблем по всему миру, вызывая примерно одну треть всех смертей в мире. Ключевые виды бактерий являются гемофильной и пневмококк 2. Однако эти виды бактерий, как правило, общие компоненты природной флоры дыхательных путей. Таким образом бактериальная каретки также определенного риска развития инвазивного заболевания и в зависимости от иммунного статуса или предрасположенности лиц. Бессимптомно колонизация срабатывает с инвазивными инфекциями. Пневмококк является ведущим возбудителем внебольничной пневмонии (CAP) и один из самых распространенных причин бактериемии у людей. У здоровых лиц С. пневмонии (пневмококки), часто протекает бессимптомно и безвредные колонизаторы верхних дыхательных путей, где они сталкиваются с непатогенных бактерийиз флорой, но и с патогенов, таких как Haemophilus SPP. или золотистый стафилококк и первая линия системы обороны иммунной человека. Ставки по транспортировке являются самыми высокими в маленьких детей (37%) и даже выше в переполненных детских садах (58%) 3-5. Самый молодой населения и пожилых людей, получив пневмококк через аэрозольной передачи от перевозчиков и носоглотки выделениями 6, принадлежат к группам высокого риска и вакцинации с использованием одного из пневмококковых конъюгированных вакцин (PCV10 или PCV13 у детей и 23-валентной полисахаридной PPSV23 у взрослых) Рекомендуется в Соединенных Штатах (США) и многих европейских странах 4. PPSV23 охватывает серотипов, ответственных за ~ 90% бактериемией пневмококковых заболеваний в США и Европе, предотвращая, таким образом, эффективно инвазивных пневмококковых заболеваний (IPD) у взрослых, в то время как PCVs охватывают наиболее распространенные серотипы у детей. Следовательно, IPD из-за типов вакцин (VT) являются РедуCED но невакцинных серотипов отображения высокой вирулентности потенциал и устойчивость к антибиотикам появились 4,7-12. Носоглотки в качестве резервуара является отправной точкой для пневмококков распространяться на пазух или среднего уха, начавших вредных местных инфекций. Что более важно, пневмококки распространяться непосредственно через дыхательные пути в бронхах и легких, в результате чего, угрожающей жизни CAP 4,13. Легочные инфекции часто сопровождаются ткани и разрушения барьера, что позволит возбудителя распространяться в кровь и вызывает IPD. Случаи CAP и IPD являются самыми высокими в ослабленным иммунитетом лиц или в крайних возрастных 4,13. Обстоятельства, ответственные за преобразование из комменсал к патогена с высокой вирулентностью находятся в стадии обсуждения. Однако, помимо изменений в восприимчивости хозяина и эволюционной адаптации сопровождается более высокой вирулентностью и увеличение сопротивления к антибиотикам были предложены иметь решающее влияние на PNEumococcal инфекции 14-16.
Возбудитель наделен множеством адгезинов посреднических тесный контакт слизистой эпителиальных клеток. После преодоления слизи в дыхательных путях, пневмококковая соблюдение клетки-хозяева, облегчается с помощью прямых взаимодействий поверхностных, подвергшихся воздействию адгезинов с клеточными рецепторами и, используя компоненты внеклеточного матрикса или сывороточных белков, как преодоление молекулам 4,17,18. Как универсальные патогены пневмококки также оснащены факторов, участвующих в уклонении от иммунной защитных механизмов. Кроме того, они имеют способность адаптироваться к различным принимающих кругах, таких как легких, крови и спинномозговой жидкости (ликвора), соответственно 5,17,19,20.
Влияние бактериальных факторов на патогенез и воспалительные принимающих ответов исследуется в экспериментальных моделях на животных пневмонии, бактериемии или менингита 21-25. Несмотря на то, патоген человека, эти модели мыLL-создан, чтобы расшифровать пневмококковой ткани тропизм, механизмы вирулентности или protectivity кандидатов пневмококковых вакцин. Генетический фон инбредных линий мышей определяет восприимчивость к пневмококков. BALB / с мышей, инфицированных интраназально пневмококков Было обнаружено, что устойчивые, а CBA / Ca и SJL мыши были более чувствительны против пневмококковых инфекций 22. Это означает, что, похожи на людей, генетического фона и принимающих защитных механизмов определить исход инфекции. Таким образом, необходимы дальнейшие усилия, чтобы разгадать сопротивления локусов в геноме мышей менее чувствительными к пневмококковых инфекций. Полученные данные привели к изменениям в в естественных условиях протоколов вирулентности. Вместо инбредных мышей BALB / с мышей, часто используемых в прошлом, очень уязвимые CD-1/MF1 беспородных линии мышей являются в настоящее время часто используется для изучения влияния потерь на-функции пневмококковой вирулентности или пригодности факторов 26-28. Кроме того, наличиебиолюминесцентной пневмококков и оптических методов визуализации позволяет в режиме реального времени биолюминесценции Bioimaging инфекций. В пневмококков оптимизированный ген кассета luxABCDE (плазмиды Paul-Tn 4001 luxABCDE Км г) был вставлен в одном месте интеграции в хромосому транспозонного мутагенеза. Биолюминесцентный пневмококки были использованы для оценки ослабления пневмококковых мутантов, дефицитных по вирулентности или фитнес-факторов и их транслокации из одной анатомической сайта на другой 26,28-31.
Здесь мы предлагаем протокол для биоизображений пневмококковых инфекций в мышиной пневмонии или сепсиса модели. Усиление и распространение биолюминесцентного пневмококков в интраназально или внутрибрюшинно инфицированных мышей можно легко контролировать с течением времени с помощью оптической системы формирования изображения и того же животного в различные моменты времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Все эксперименты, проведенные на животных, должны быть одобрены местными властями и комиссий по этике. В естественных условиях в инфекции экспериментов бактериальная нагрузка в различных принимающих нишах зараженных животных должно быть определено в различные моменты време?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории при поддержке грантов от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) и Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF) Медицинская инфекции геномики (ФКЗ 0315828A) в SH.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
References
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P., Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm, , et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
