ECM Protein Nanofibers og nanostrukturer Engineered Brug Surface-initierede Assembly
Summary
En metode til at opnå nanofibre og komplekse nanostrukturer fra en enkelt eller flere ekstracellulære matrixproteiner er beskrevet. Denne fremgangsmåde anvender protein-overflade vekselvirkninger at skabe fritstående protein-baserede materialer med afstemmelige sammensætning og arkitektur til brug i en række af væv ingeniør-og bioteknologiske anvendelser.
Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) i væv syntetiseres og samles af celler til dannelse af et 3D-fibrillært protein netværk med stramt reguleret fiberdiameter, sammensætning og organisation. Ud over at yde strukturel støtte, de fysiske og kemiske egenskaber af ECM spiller en vigtig rolle i flere cellulære processer, herunder friktion, differentiering og apoptose. In vivo er ECM samles ved at udsætte kryptiske selvsamling (fibrillogenese) steder indenfor proteiner . Denne proces varierer for forskellige proteiner, men fibronectin (FN)-fibrillogenese er godt karakteriseret og tjener som model for cellemedieret ECM forsamling. Konkret celler bruger integrinreceptorer på cellemembranen til at binde FN dimerer og actomyosin-genereret kontraktile kræfter til at udfolde sig, og eksponere bindingssteder for montage i uopløselige fibre. Denne receptor-medieret proces gør det muligt for cellerne at samle og organisere ECM fra det cellulære til væv SCAles. Her præsenterer vi en metode kaldet overflade-initierede samling (SIA), der sammenfatter cellemedieret matrixopbygning anvendelse af protein-overflade vekselvirkninger at udfolde ECM-proteiner og samle dem til uopløselige fibre. Først ECM-proteiner adsorberet på en hydrofob polydimethylsiloxan (PDMS) overfladen, hvor de delvis denaturering (unfold) og udsætte kryptiske bindende domæner. Udfoldet proteiner overføres derefter i veldefinerede mikro-og nanopatterns gennem microcontact udskrivning på en termisk reagerende poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) overflade. Termisk-udløst opløsning af PIPAAm fører til den endelige samling og frigivelse af uopløselige ECM protein nanofibre og nanostrukturer med veldefinerede geometrier. Komplekse arkitekturer er muligt ved ingeniør definerede mønstre på PDMS stempler til microcontact udskrivning. Ud over FN kan SIA-processen anvendes med laminin, fibrinogen og collagener type I og IV til at skabe flere komponenter ECM nanostructurer. Således kan SIA anvendes til at konstruere ECM protein-baserede materialer med præcis kontrol over proteinsammensætningen fiber geometri og stillads arkitektur med henblik på at rekapitulere strukturen og sammensætningen af ECM in vivo.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) i væv består af multifunktionelle proteiner involveret i fysisk og kemisk regulering af flere celleprocesser, herunder adhæsion, proliferation, differentiering og apoptose 1-3. ECM er syntetiseret, samlet, og tilrettelagt af celler, og de indgående protein fibriller har unikke kompositioner, fiber størrelse, geometrier og indbyrdes forbundne arkitekturer, der varierer med vævstypen og udviklingsstadiet. Nyligt arbejde har vist, at ECM kan give instruktive stikord til at guide cellerne danner manipuleret væv 4, hvilket tyder på, at den gentog ECM i form af sammensætning og struktur kan muliggøre udviklingen af biomimetiske materialer til tissue engineering og bioteknologiske anvendelser.
En række fremstillingsmetoder er blevet udviklet til at konstruere polymere stillads, der kan efterligne aspekter af ECM i væv. For eksempel electrospinning og fase separtion har begge demonstreret evne til at danne porøse matricer af fibre med diametre fra snesevis af mikrometer ned til et tocifret antal nanometer 5-7. Begge teknikker har også vist, at meget porøse matrixer af nanofibers kan støtte celleadhæsion og infiltration i stilladset 8. Men disse tiltag er begrænset i de mulige fiber geometrier, retningslinjer og 3D-arkitekturer, der kan oprettes. Electrospinning producerer typisk stilladser med enten tilfældigt orienterede eller meget aligned fibre henviser faseseparation producerer stilladser med tilfældigt orienterede fibre. Der er også begrænsninger på materialer, med forskere typisk under anvendelse af syntetiske polymerer, såsom poly (ε-caprolacton) 8 og poly (mælke-co-glycolsyre) 9, som efterfølgende overtrukket med ECM-proteiner for at fremme celleadhæsion. Naturlige biopolymerer også anvendes, herunder kollagen type I 10, gelatine 11, fibrinogen 12chitosan 13 og silke 14, men udgør kun en lille delmængde af de proteiner, der findes i native væv. De fleste væv indeholder et større miljø af ECM-proteiner og polysaccharider herunder fibronectin (FN), laminin (LN), collagen type IV og hyaluronsyre, der er vanskelige eller umulige at fremstille nanofibers anvendelse af eksisterende fremgangsmåder.
For at løse denne udfordring, har vi fokuseret vores forskningsindsats på at efterligne den måde celler syntetisere, samle og organisere ECM protein fibriller i deres omgivelser. Mens den specifikke fibrillogenese proces varierer for forskellige ECM-proteiner, typisk en konformationsændring i ECM protein molekyle er udløst af en enzymatisk eller receptor-medieret interaktion, som udsætter kryptiske selvsamlingsproceser sites. Her bruger vi FN som et modelsystem for bedre at forstå fibrillogenese processen. Kort fortalt FN homodimerer binder til integrin-receptorer på celleoverfladen via RGD aminosyre sekvensen i den 10. type IIJeg gentager enhed. Når bundet, integrinerne flytte fra hinanden via actomyosin sammentrækning og udfolde Fn dimerer at eksponere kryptiske selvsamlingsproceser sites. Eksponeringen af disse FN-FN bindingssteder giver Fn dimerer at samle ind i en uopløselig fibril højre på celleoverfladen 15. Arbejde i celle-fri systemer har vist, at kryptiske FN-FN bindingssteder kan afsløres gennem udfoldelsen hjælp denatureringsmidler 16 eller overfladespænding på en luft-væske-faststof grænseflade 17-19. Men Fn fibre skabt af disse teknikker er begrænset til specifikke fiber størrelser og geometrier og er typisk bundet til en overflade.
Her beskriver vi en tilgang betegnes overflade-initierede samling (SIA) 20, der overvinder disse begrænsninger ved at bruge protein-overflade vekselvirkninger til at oprette fritstående uopløselige nanofibre, nanofabrics (2D ark) og andre nanostrukturer, der består af en enkelt eller flere ECM-proteiner (figur 1 ). I denne pprocesmodeller, er ECM-proteiner adsorberes fra en kompakt, kugleformet kropsbygning i opløsning og delvist denatureret (udfoldet) på en mønstret, hydrofob polydimethylsiloxan (PDMS) stempel. ECM-proteiner overføres derefter i denne tilstand på et termisk reagerende poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) overfladen gennem microcontact udskrivning 22. Når hydreret med 40 ° C vand PIPAAm er et fast stof, men når den afkøles til 32 ° C, passerer gennem en nedre kritiske opløsningstemperatur (LCST), hvor det bliver hydrofile, kvælder med vand og derefter opløses, frigiver de samlede ECM nanostrukturer off overfladen. SIA metode giver kontrol over de dimensioner med nanometer-skala præcision. Ved at kontrollere vigtige parametre, såsom sammensætning, fiber geometri og arkitektur, er det muligt at rekapitulere mange egenskaber af ECM fundet in vivo, og udvikle avancerede stativer til vævs-engineering og bioteknologiske anvendelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
SID-metoden præsenteres her efterligner cellemedieret matrixopbygning og muliggør konstruktionen af ECM protein nanofibre og nanostrukturer med tunable størrelse, organisation og sammensætning. Selvom det ikke er identisk med celle-genereret ECM, SIA skaber ECM består af nanoskala protein fibriller 20, som undergår reversible folde / udfolde under mekanisk belastning 21 og kan binde celler 20. Dette giver en unik mulighed for at opbygge ECM protein materialer, rekapitulere ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Blev ydet økonomisk støtte til JMS fra NIH Biomekanik i regenerativ medicin T32 Training Program (2T32EB003392), til QJ fra Dowd-ICES Fellowship og AWF fra NIH direktørens New Innovator Award (1DP2HL117750).
Materials
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. . Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -. M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. . Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -. J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
