Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho
Summary
A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.
Abstract
A parede celular bacteriana é fundamental para a determinação da forma celular durante o crescimento e divisão, e mantém a integridade mecânica das células diante das pressões turgor várias atmosferas em magnitude. Através das diversas formas e tamanhos do reino bacteriano, a parede celular é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos curtos. A importância central do peptidoglycan para a fisiologia bacteriana está por trás de seu uso como alvo antibiótico e motivou estudos genéticos, estruturais e biológicos celulares de como ele é fortemente montado durante o crescimento e divisão. No entanto, investigações extensas ainda são necessárias para caracterizar plenamente as principais atividades enzimáticas na síntese peptidoglycan e na composição química das paredes celulares bacterianas. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) é um poderoso método analítico para quantificar diferenças na composição química das paredes de bactérias cultivadas sob uma variedade de condições ambientais e genéticas, mas sua produção é muitas vezes limitada. Aqui, apresentamos um procedimento simples para o isolamento e preparação de paredes celulares bacterianas para análises biológicas de peptidoglycan via HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), uma extensão do HPLC que utiliza bombas para fornecer pressões ultra-altas de até 15.000 psi, em comparação com 6.000 psi para HPLC. Em combinação com a preparação de paredes celulares bacterianas apresentadas aqui, os injetores de amostra de baixo volume, detectores com altas taxas de amostragem, volumes amostrais menores e tempos de execução mais curtos de UPLC permitirão alta resolução e throughput para novas descobertas de composição peptidoglycan e biologia celular bacteriana fundamental na maioria dos laboratórios biológicos com acesso a um ultracentrifuge e UPLC.
Introduction
O objetivo do método aqui descrito é isolar paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) e digerir o peptidoglycan (PG) de modo que a Cromatografia Líquida Ultra Performance (UPLC) possa ser usada para fornecer informações como a identidade dos componentes do muropeptídeo e suas concentrações, o comprimento médio dos fios glicanos e a fração do material envolvido em crosslinks entre fios. Para uma discussão detalhada das espécies de bioquímica e muropeptídeos de PG, existem várias excelentes revisões que descrevem a estrutura pg e seu papel na infecção, resistência, morfogênese e crescimento1-6. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) para análise pg foi inicialmente desenvolvida por Glauner e Schwarz na década de 1980, e mais recentemente foi aprimorada e aplicada extensivamente nos laboratórios de Miguel de Pedro e Waldemar Vollmer. Métodos anteriores utilizaram análise de aminoácidos ou cromatografia de papel, técnicas demoradas e tediosas que não produzem avaliações precisas ou completas de componentes da parede celular.
A análise uplc pode ser facilmente implementada em qualquer laboratório de pesquisa básica que tenha acesso a um ultracentrifuge e UPLC. O método UPLC que apresentamos abaixo isola saccultos completos, fornecendo informações quantitativas e abrangentes sobre todas as espécies químicas nelas. Este método produz quantificação precisa de todos os muropeptídeos em uma população de bactérias, tudo dentro de uma corrida UPLC de 20 minutos. A implementação desse método envolve apenas habilidades básicas de laboratório, sem investimento financeiro significativo em materiais. Para executar as etapas deste método, os pesquisadores só precisam ser qualificados em pipetting, preparação de tampões e enzimas, e ajuste do pH, tornando-o acessível a uma ampla gama de disciplinas científicas. A escolha das enzimas utilizadas neste protocolo depende da espécie de bactéria a ser analisada; o protocolo descrito aqui é útil para Escherichia coli, e tem sido geralmente encontrado como adequado para isolar saccultos de outros organismos Gram-negativos. Recomenda-se consulta à literatura na aplicação deste método a bactérias Gram-positivas; nestas espécies, a purificação do sacculus tem sido tradicionalmente mais difícil. Em particular, este método pode ter que ser alterado em termos de escolha enzimática e tempo de digestão para acomodar as paredes mais grossas e polímeros acessórios, como ácidos teicóicos de bactérias Gram-positivas. A primeira enzima neste protocolo corta a lipoproteína da membrana externa (como a lipoproteína de Braun, ou Lpp) apego ao peptidoglycan, liberando assim todos, exceto o peptídeo C-terminal di-(ou tri-) do Lpp da parede celular. Esta etapa é necessária ao examinar enterobactérias, mas muitas outras bactérias Gram-negativas não têm equivalentes de Lpp, e portanto essa etapa pode ser ignorada. Uma segunda enzima especificamente se acovarda após o componente ácido murâmico do peptidoglycan, solubilizando a subunidade descaramento que forma a espécie muropeptídeo. Para fornecer uma avaliação precisa da arquitetura do PG, deve-se tomar cuidado ao digerir os saccultos para evitar o decote das pontes cruzadas ou qualquer outra parte da haste de peptídeo.
Embora as composições químicas de peptidoglycan de mais de 100 cepas de ~40 espécies bacterianas tenham sido analisadas pelo HPLC, nenhuma análise foi realizada com a tecnologia UPLC. Além disso, trabalhos anteriores caracterizaram peptidoglycan a partir de apenas uma pequena fração do domínio bacteriano, em parte limitado pelo rendimento do HPLC. Portanto, a disseminação desse método para o maior número possível de pesquisadores, e a implementação em plataformas UPLC, será fundamental para conduzir estudos fisiológicos da grande fração de espécies bacterianas cujo peptidoglycan ainda não foi categorizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um passo crítico neste procedimento é a etapa 3.1 do segundo dia de preparação da amostra. Se o SDS precipitou durante a noite, ou se as amostras foram armazenadas em 4% de SDS por várias semanas em temperatura ambiente, as amostras devem ser rebovadas por pelo menos 1 hora para ressolar o SDS. Uma causa comum para a precipitação de SDS é o uso de mídia com sais de potássio, por isso o potássio deve ser evitado na mídia, se possível. Como mencionado na seção Resultados Representativos, também é fundament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio Novo Inovador do Diretor do NIH DP2OD006466 (para K.C.H.). Os autores agradecem a Russell Monds por uma demonstração prática do método e pelas discussões científicas.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
