Определение ледовязающих плоскостей антифризовых белков с помощью флуоресценции на основе аффинити ледовой плоскости
Summary
Антифризовые белки (AFPs) связываются с определенными плоскостями льда для предотвращения или замедления роста льда. Анализ сродства ледовых плоскостей на основе флуоресценции (FIPA) является модификацией оригинального метода травления льда для определения ледовых плоскостей, связанных с AFP. AFPs флуоресцентно помечены, включены в макроскопические одиночные кристаллы льда, и визуализированы под ультрафиолетовым светом.
Abstract
Антифризные белки (AFPs) выражаются в различных холодоугодных организмах для предотвращения или замедления внутреннего роста льда. AFPs связывают к специфически плоскостям льда через их лед-связывающие поверхности. Анализ сродства ледяной плоскости на основе флуоресценции (FIPA) представляет если использоваться для определения ледяных плоскостей, к которым связываются AFPs. FIPA основана на оригинальном методе офорта льда для определения ледовых самолетов, связанных с AFP. Он производит более четкие изображения в сокращенное экспериментальное время. В анализе FIPA, AFPs флуоресцентно помечены химерным тегом или ковалентным красителем, затем медленно включаются в макроскопический одиночный кристалл льда, который был предварительно создан в полушарии и ориентирован для определения а- и c-осей. Ледяное полушарие, связанное с AFP, изображено под ультрафиолетовым светом для визуализации плоскостей, связанных с AFP, с помощью фильтров для блокирования неспецифического света. Флуоресцентная маркировка AFPs позволяет в режиме реального времени контролировать Аосорпирование AFP во льду. Было установлено, что этикетки не влияют на самолеты, к которым связывают afPs. Анализ FIPA также вводит возможность связывать более одного по-разному помеченного AFP на одном и том же кристалле льда, чтобы помочь дифференцировать их связывающие плоскости. Эти применения FIPA помогают продвинуть наше понимание того, как AFPs связываются со льдом, чтобы остановить его рост и почему многие организмы, производящие AFP, выражают многочисленные АФП-изоформы.
Introduction
Производство антифризовых белков (AFPs) является важным механизмом выживания некоторых организмов, которые живут в среде, нагруженной льдом. До недавнего времени считалось, что единственной функцией AFPs было предотвращение или замедление роста внутренних кристаллов льда, которые блокировали бы кровообращение, причиняли повреждение тканей и осмотическое напряжение. Организмы, которые не могут терпеть какой-либо степени замерзания, такие как рыба, выражают AFPs полностью препятствовать росту кристалла льда1. Другие, такие как трава, замерзают толерантно и выражают AFPs для того чтобы ингибировать recrystallization льда который уменьшает образование больших кристаллов льда в ихтканях 2. Стабилизация мембран при низкой температуре является еще одной функцией, которая была предложена для AFPs3. Недавно была предложена новая роль для AFP антарктической бактерии, Marinomonas primoryensis, от покрытых льдом солоноватыхозер 4. Это AFP является частью гораздо большего белка адгезин5, который, как полагают, прикрепить бактерии к льду для лучшего доступа к кислороду и питательнымвеществам 6. Другие микробы, как известно, выделяет AFPs, которые могут изменить структуру льда, в котором они живут7.
AFPs были найдены в некоторых рыб, насекомых, растений, водорослей, бактерий, диатомовых и грибков. Они имеют удивительно различные последовательности и структуры в соответствии с их эволюцией от различных прародителей в различных случаях; и все же все они связываются со льдом и препятствуют его росту механизмом ингибирования адсорбции8. AFPs каждый из них имеет определенную поверхность, которая выступает в качестве своего ледовязательного участка (IBS). Они, как правило, были определены на сайте направлены мутагенез поверхностныхостатков 9-11. Предполагается, что IBS организует молекулы воды в ледопоем узоре, который соответствует конкретным плоскостям льда. Таким образом AFP формирует свой ligand перед связывать к ему5, 12. Ледяные плоскости могут быть определены их индексами Миллера, и различные AFPs могут связываться с различными плоскостями. Таким образом, тип I AFP от зимней камбалы связывается с 20-21 пирамидальныхплоскостей 13, тип III AFP связывает как первичную призму и пирамидальные плоскости с помощью соединения ледовязнойповерхности 11,14, в то время как ели budworm AFP, гиперактивный AFP, связывается одновременно как с первичными и базальнымиплоскостями 15,16. Другие гиперактивные AFPs, такие как MpAFP, связываются с несколькими плоскостями льда, о чем свидетельствует их полное покрытие одного полушариякристалла льда 5,17. Предполагается, что способность гиперактивных AFPs связывать базальные плоскости, а также другие плоскости, может объяснить их 10-кратную более высокую активность над умеренно активными AFPs18. Хотя эффективность гиперактивных AFPs хорошо документирована, их способность связываться с несколькими плоскостами льда до сих пор не понята.
Оригинальный метод определения AFP-связанных ледяных самолетов был разработан Чарльз Найт13,19. В этом методе макроскопический одиночный кристалл льда устанавливается на полый металлический стержень (холодный палец) и образуется в полушарии, погружая его в полушарие чашку, наполненную дегазацией воды. Затем полушарие погружается в разбавленный раствор AFPs и слой льда выращивается из раствора AFP в полушарии кристалла льда в течение нескольких часов, контролируемых температурой этиленгликола, циркулирующего через холодный палец. Кристалл льда удаляется из раствора, отделяется от холодного пальца и помещается в морозильную камеру от -10 до -15 градусов по Цельсию. Поверхность соскаблит острым лезвием, чтобы удалить замороженную поверхностную пленку раствора белка антифриза, а кристалл льда может сублимироваться не менее 3 часов. После сублимации ледяные плоскости, связанные AFPs, можно рассматривать как белые травленные узоры, полученные из остаточного белка. Ледяное полушарие может быть ориентировано на его c-оси иосей, чтобы найти базальные и призмы плоскостей льда, и определить миллер индексы травления патчи.
Здесь мы описываем модификацию оригинального метода определения AFP-связанных плоскостей льда, метод, который мы называем флуоресценцией на основе сродства ледяной плоскости (FIPA)11. AFPs флуоресцентно помечены либо химерные метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP)11,16,17,20, или с флуоресцентным красителем ковалентно связаны с AFP5,21. Флуоресцентно помеченные AFPs адсорбированы к одному кристаллу льда и заросли с помощью той же экспериментальной процедуры, что и оригинальные эксперименты по травлению льда. Степень привязки AFP к растущему полушарию льда может контролироваться на протяжении всего эксперимента с помощью ультрафиолетовой (УФ) лампы. После завершения эксперимента полушарие может быть непосредственно снято с холодного пальца и изображено без сублимации. Однако, при желании, полушарие может быть оставлено на сублимировать, чтобы визуализировать традиционный ледяной etch. Изменения, внесенные в методологию FIPA, сокращают традиционный протокол травления льда на несколько часов. Кроме того, существует потенциал для одновременного изображения нескольких AFPs, каждый с другой флуоресцентной этикеткой, чтобы визуализировать перекрывающиеся модели AFP-связанных ледяных плоскостей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработка метода вытравливания льда Чарльзом Найтом для определения связанных AFP ледовых плоскостей значительно продвинула исследования механизма связывания льда СФП. В то время как структуры AFPs могут быть решеныс помощью рентгеновской кристаллографии 26,27 не было очевидного ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLD занимает кафедру исследований в Области белковой инженерии. Эта работа финансировалась за счет гранта Канадских институтов исследований в области здравоохранения на PLD. Эта работа была также поддержана Грант-в-помощи для научных исследований от Японского общества содействия науке (JSPS) (No 23310171) и от Японского института био-ориентированных технологий научно-исследовательский институт (BRAIN). Мы благодарны докторам Крису Маршаллу и Майку Койперу за новаторскую работу, которая привела к FIPA. Мы также признательны д-ру Сакаэ Цуде за предоставление возможностей для некоторых из этих работ и д-ру Лори Грэму за создание флуоресцентных световых возбуждений и фильтров выбросов.
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry – heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.”>Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. 생화학. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ”perfect” ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. . Ice physics. , 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. 생화학. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
