Bestämma isbindande plan för frostskyddsproteiner genom fluorescensbaserad isplanstillhörighet
Summary
Frostskyddsmedel (AFPs) binder till specifika isplan för att förhindra eller bromsa istillväxten. Fluorescensbaserad isplanstillhörighet (FIPA) analys är en modifiering av den ursprungliga is-etsningsmetoden för bestämning av AFP-bundna isplan. AFPs är fluorescerande märkta, införlivade i makroskopiska enstaka iskristaller och visualiserade under UV-ljus.
Abstract
Frostskyddsmedel (AFPs) uttrycks i en mängd kalla hårdföra organismer för att förhindra eller bromsa den inre istillväxten. AfPs binder till specifika isplan genom sina isbindande ytor. Fluorescensbaserad fipa-analys (Ice Plane Affinity) är en modifierad teknik som används för att bestämma de isplan som AFP:erna binder till. FIPA bygger på den ursprungliga isetsningsmetoden för att bestämma AFP-bundna isplan. Det ger tydligare bilder på kortare försökstid. I FIPA-analys är AFP fluorescerande märkta med en chimerisk tagg eller ett kovalent färgämne och införlivas sedan långsamt i en makroskopisk enda iskristall, som har förformats till ett halvklot och är orienterad för att bestämma a- och c- axlarna. Den AFP-bundna ishalvan avbildas under UV-ljus för att visualisera AFP-bundna plan med hjälp av filter för att blockera ospecificerat ljus. Fluorescerande märkning av AFPs möjliggör realtidsövervakning av AFP-adsorption i is. Etiketterna har visat sig inte påverka de plan som afp-adresser binder till. FIPA-analys introducerar också möjligheten att binda mer än en olikmärkt AFP på samma enda iskristall för att hjälpa till att skilja deras bindande plan åt. Dessa tillämpningar av FIPA bidrar till att öka vår förståelse för hur AFP binder till is för att stoppa dess tillväxt och varför många AFP-producerande organismer uttrycker flera AFP-isoformer.
Introduction
Produktionen av frostskyddsmedel (AFP) är en viktig överlevnadsmekanism hos vissa organismer som lever i isfyllda miljöer. Fram till nyligen trodde man att afps enda funktion var att förhindra eller bromsa tillväxten av inre iskristaller som skulle blockera cirkulationen, orsaka vävnadsskador och osmotisk stress. Organismer som inte tål någon grad av frysning, såsom fisk, uttrycker AFPs för att helt hämma iskristalltillväxt1. Andra, såsom gräs, är frystoleranta och uttrycker AFPs för att hämma isomkristallisering som minskar bildandet av stora iskristaller i derasvävnader 2. Stabilisering av membran vid låg temperatur är ännu en funktion som föreslogs för AFPs3. Nyligen föreslogs en ny roll för AFP av en antarktisk bakterie, Marinomonas primoryensis, från istäckta bräckta sjöar4. Denna AFP är en del av ett mycket större adhesinprotein5 som tros fästa bakterien på is för bättre tillgång till syre och näringsämnen6. Andra mikrober är kända för att utsöndra AFPs, vilket kan förändra strukturen hos den is där de bor7.
AFPs har hittats i vissa fiskar, insekter, växter, alger, bakterier, kiselalger och svampar. De har anmärkningsvärt olika sekvenser och strukturer som överensstämmer med deras utveckling från olika stamceller vid olika tillfällen; och ändå binder de alla till is och hämmar dess tillväxt genom adsorptionshämningsmekanismen8. AfPs har var och en en en specifik yta som fungerar som dess isbindningsställe (IBS). Dessa har vanligtvis identifierats genom platsstyrd mutagenes av ytrester9-11. IBS är hypotesen att ordna vattenmolekyler i ett isliknande mönster som matchar specifika isplan. Således bildar AFPen dess ligand, innan att binda till den5, 12. Isplan kan definieras av deras Miller-index, och olika AFP:er kan binda till olika plan. Således binder typ I AFP från vinterflounder till 20-21 pyramidplan13, typ III AFP binder både primära prisma- och pyramidalplan med hjälp av en sammansatt isbindningsyta11,14, medan granknoppmasken AFP, en hyperaktiv AFP, binder samtidigt till både de primära och basala planen15,16. Andra hyperaktiva AFPs, såsom MpAFP, binder till flera isplan som framgår av deras fullständiga täckning av englashalvor5,17. Det är hypotesen att hyperaktiva AFPs förmåga att binda basalplanet, liksom andra plan, kan stå för deras 10-faldiga högre aktivitet över måttligt aktiva AFPs18. Även om effektiviteten hos hyperaktiva AFPs är väl dokumenterad, är deras förmåga att binda till flera isplan fortfarande inte förstådd.
Den ursprungliga metoden för att bestämma de AFP-bundna isplanen utvecklades av Charles Knight13,19. I denna metod monteras en makroskopisk enda iskristall på en ihålig metallstav (kallt finger) och bildas till ett halvklot genom att nedsänka den till en halvklotformad kopp fylld med avgasat vatten. Sedan är halvklotet nedsänkt i en utspädd lösning av AFPs och ett lager is odlas från AFP-lösningen på iskristallhalvan under flera timmar som styrs av temperaturen på etylenglykol som cirkulerar genom det kalla fingret. Iskristallen avlägsnas från lösningen, lossnar från det kalla fingret och placeras i ett -10 till -15 °C frysrum. Ytan skrapas med ett vasst blad för att ta bort den frusna ytfilmen av frostskyddsproteinlösning och iskristallen får sublimera i minst 3 timmar. Efter sublimering kan isplan som binds av AFP ses som vita etsade mönster som härrör från restprotein. Ishalvan kan vara inriktad på dess c-axel och en-axlar, för att lokalisera de basala och prisma planen av is, och bestämma Miller index för de etsade fläckarna.
Här beskriver vi en ändring av den ursprungliga metoden för att bestämma AFP-bundna isplan, en metod som vi kallar fluorescensbaserad isplanstillhörighet (FIPA)11. AFP:erna är fluorescerande märkta med antingen en chimerisk tagg, såsom grönt fluorescerande protein (GFP)11,16,17,20, eller med ett fluorescerande färgämne som är kovalent bundet till AFP5,21. Fluorescerande märkta AFPs adsorberas till en enda iskristall och övervuxen med samma experimentella förfarande som de ursprungliga isetsningsexperimenten. Omfattningen av AFP som binder till den växande ishalvan kan övervakas under hela experimentet med hjälp av en ultraviolett (UV) lampa. När experimentet är klart kan halvklotet tas direkt av det kalla fingret och avbildas, utan sublimering. Men om så önskas kan halvklotet lämnas att sublimera för att visualisera en traditionell is etch. Ändringar som införts i FIPA-metoden förkortar det traditionella isetsningsprotokollet med flera timmar. Dessutom finns det potential för att samtidigt avbilda flera AFPs, var och en med en annan fluorescerande etikett, för att visualisera de överlappande mönstren hos AFP-bundna isplan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Charles Knights utveckling av isetsningsmetoden för bestämning av AFP-bundna isplan har i hög grad avancerat studier om mekanismen för isbindning av afps. Medan strukturer av AFP kunde lösas genom röntgenkristallografi26,27 fanns det ingen uppenbar metod för att härleda den kompletterande ytan på is som AFP band till. När typ I AFP från vinter skrubbskädda ursprungligen karakteriserades, var det hypotetiskt att binda till de primära prisma planen av is28. Knights banbrytande isetsningse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLD innehar Canada Research Chair i proteinteknik. Detta arbete finansierades av ett bidrag från Canadian Institutes of Health Research till PLD. Detta arbete stöddes också av ett bidrag till stöd för vetenskaplig forskning från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr 23310171) och från Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Vi är tacksamma mot Drs. Chris Marshall och Mike Kuiper för banbrytande arbete som ledde till FIPA. Vi är också tacksamma mot Dr. Sakae Tsuda för att tillhandahålla faciliteter för en del av detta arbete och till Dr. Laurie Graham för att ha inrättat fluorescerande ljusexcitations- och utsläppsfilter.
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry – heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.”>Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. 생화학. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ”perfect” ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. . Ice physics. , 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. 생화학. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
