Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence
Summary
Les protéines antigel (AFPs) se lient à des plans de glace spécifiques pour prévenir ou ralentir la croissance de la glace. L’analyse d’affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence est une modification de la méthode originale de gravure sur glace pour la détermination des plans de glace liés à l’AFP. Les ADP sont marqués par fluorescence, incorporés dans des cristaux de glace simples macroscopiques et visualisés sous la lumière UV.
Abstract
Les protéines antigel (AFPs) sont exprimées dans une variété d’organismes résistants au froid pour prévenir ou ralentir la croissance interne de la glace. Les ALP se lient à des plans de glace spécifiques à travers leurs surfaces de liaison à la glace. L’analyse d’affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence est une technique modifiée utilisée pour déterminer les plans de glace auxquels les APL se lient. L’APIE est fondé sur la méthode originale de gravure sur glace pour déterminer les avions à glace liés à la PFA. Il produit des images plus claires dans un temps expérimental raccourci. Dans l’analyse APIE, les AFA sont marqués par fluorescence à l’aide d’une étiquette chimérique ou d’un colorant covalent, puis lentement incorporés dans un cristal de glace unique macroscopique, qui a été préformé dans un hémisphère et orienté pour déterminer les axes a et c. L’hémisphère de glace lié à l’AFP est céf sous la lumière UV pour visualiser les plans liés à l’AFP à l’aide de filtres pour bloquer la lumière non spécifique. Le étiquetage fluorescent des AFP permet une surveillance en temps réel de l’adsorption de la PFA dans la glace. Il a été constaté que les étiquettes n’influencent pas les avions auxquels les ALP se lient. L’analyse APIE introduit également la possibilité de lier plus d’un AFP étiqueté différemment sur le même cristal de glace unique pour aider à différencier leurs plans de liaison. Ces applications de l’APIE nous aident à mieux comprendre comment les AFP se lient à la glace pour arrêter sa croissance et pourquoi de nombreux organismes producteurs de PFA expriment de multiples isoformes de la PFA.
Introduction
La production de protéines antigel (ADP) est un mécanisme de survie important de certains organismes qui vivent dans des environnements chargés de glace. Jusqu’à récemment, on pensait que la seule fonction des ADP était de prévenir ou de ralentir la croissance des cristaux de glace internes qui bloqueraient la circulation, causeraient des lésions tissulaires et un stress osmotique. Les organismes qui ne tolèrent aucun degré de congélation, comme les poissons, expriment des ADP pour inhiber complètement la croissance des cristaux de glace1. D’autres, comme l’herbe, sont tolérants au gel et expriment des ADP pour inhiber la recristallisation de la glace, ce qui réduit la formation de gros cristaux de glace dans leurs tissus2. La stabilisation des membranes à basse température est encore une autre fonction qui a été suggérée pour les AAP3. Récemment, un nouveau rôle a été suggéré pour l’AFP d’une bactérie antarctique, Marinomonas primoryensis, provenant de lacs saumâtres recouverts de glace4. Cet AFP fait partie d’une protéine adhésine5 beaucoup plus grande qui est censée attacher la bactérie à la glace pour un meilleur accès à l’oxygène et aux nutriments6. D’autres microbes sont connus pour sécréter des ADP, ce qui pourrait modifier la structure de la glace dans laquelle ils vivent7.
Des ADP ont été trouvés chez certains poissons, insectes, plantes, algues, bactéries, diatomées et champignons. Ils ont des séquences et des structures remarquablement divergentes compatibles avec leur évolution à partir de différents progéniteurs à diverses occasions; et pourtant ils se lient tous à la glace et inhibent sa croissance par le mécanisme d’adsorption-inhibition8. Les AAP ont chacun une surface spécifique qui agit comme son site de liaison aux glaces (SII). Ceux-ci ont généralement été identifiés par mutagenèse dirigée vers le site des résidus de surface9-11. On présume que l’IBS dispose les molécules d’eau selon un motif semblable à celui de la glace qui correspond à des plans de glace spécifiques. Ainsi l’AFP forme son ligand avant de s’y lier5, 12. Les plans de glace peuvent être définis par leurs indices de Miller, et différents AAP peuvent se lier à différents plans. Ainsi, l’AFP de type I de la plie rouge se lie aux 20-21 plans pyramidaux13,l’AFP de type III lie à la fois le prisme primaire et le plan pyramidal à l’aide d’une surface de liaison à la glace composée11,14, tandis que la tordeuse des bourgeons de l’épinette AFP, une AFP hyperactive, se lie simultanément aux plans primaire et basal15,16. D’autres AFP hyperactifs, tels que mpAFP, se lient à plusieurs avions de glace comme le montre leur couverture complète des hémisphères de cristal de glace simples5,17. On le présume, que la capacité des AAP hyperactifs à lier le plan basal, ainsi que d’autres plans, peut expliquer leur activité 10 fois plus élevée que les AOP modérément actifs18. Bien que l’efficacité des ADP hyperactifs soit bien documentée, leur capacité à se lier à plusieurs avions de glace n’est toujours pas comprise.
La méthode originale pour déterminer les avions de glace à destination de l’AFP a été développée par Charles Knight13,19. Dans cette méthode, un cristal de glace unique macroscopique est monté sur une tige métallique creuse (doigt froid) et formé dans un hémisphère en le submergeant dans une tasse hémisphérique remplie d’eau dégazée. Ensuite, l’hémisphère est immergé dans une solution diluée d’AFP et une couche de glace est cultivée à partir de la solution AFP sur l’hémisphère cristallin de glace pendant plusieurs heures contrôlées par la température de l’éthylène glycol circulant à travers le doigt froid. Le cristal de glace est retiré de la solution, détaché du doigt froid et placé dans une salle de congélation de -10 à -15 °C. La surface est grattée avec une lame tranchante pour éliminer le film de surface congelé de la solution protéique antigel et le cristal de glace est laissé sublimer pendant au moins 3 heures. Après sublimation, les plans de glace liés par les AFFA peuvent être vus comme des motifs gravés blancs dérivés de protéines résiduelles. L’hémisphère de glace peut être orienté vers ses axes cet a,pour localiser les plans basal et prisme de la glace, et déterminer les indices de Miller des taches gravées.
Nous décrivons ici une modification de la méthode originale de détermination des plans de glace liés à l’AFP, une méthode que nous appelons affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence11. Les AFP sont marqués par fluorescence soit avec une étiquette chimérique, telle que la protéine fluorescente verte (GFP)11,16,17,20,soit avec un colorant fluorescent lié de manière covalente à l’AFP5,21. Les ADP marqués par fluorescence sont adsorbés sur un seul cristal de glace et envahis par la prolifération en utilisant la même procédure expérimentale que les expériences originales de gravure sur glace. L’étendue de la liaison de l’AFP à l’hémisphère de glace en croissance peut être surveillée tout au long de l’expérience à l’aide d’une lampe ultraviolette (UV). Une fois l’expérience terminée, l’hémisphère peut être directement retiré du doigt froid et ességé, sans sublimation. Cependant, si vous le souhaitez, l’hémisphère peut être laissé à sublimer pour visualiser une gravure sur glace traditionnelle. Les modifications apportées à la méthodologie de l’APIE raccourcissent de plusieurs heures le protocole traditionnel de gravure sur glace. De plus, il est possible d’imager simultanément plusieurs AFP, chacun avec une étiquette fluorescente différente, pour visualiser les modèles qui se chevauchent des plans de glace liés à l’AFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le développement de la méthode de gravure sur glace par Charles Knight pour la détermination des avions à glace liés à l’AFP a considérablement fait progresser les études sur le mécanisme de liaison à la glace par les AFP. Alors que les structures des AFP pouvaient être résolues par cristallographie aux rayons X26,27, il n’existait pas de méthode évidente pour déduire la surface complémentaire sur la glace à laquelle l’AFP se limitait. Lorsque l’AFP de type I de la plie rouge a été i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLD est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en génie des protéines. Ces travaux ont été financés par une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada à la PLD. Ce travail a également été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (n ° 23310171) et de la Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Nous sommes reconnaissants aux Drs Chris Marshall et Mike Kuiper pour leur travail de pionnier qui a mené à l’APIE. Nous sommes également reconnaissants au Dr Sakae Tsuda d’avoir fourni des installations pour certains de ces travaux et au Dr Laurie Graham d’avoir mis en place les filtres d’excitation et d’émission de lumière fluorescente.
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
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