Bottom-up et de fusil de chasse protéomique pour identifier une complète Cochlear protéome
Summary
l'analyse de protéome de l'épithélium sensoriel cochléaire peut être difficile en raison de sa petite taille et parce que les protéines membranaires sont difficiles à isoler et à identifier. Les deux protéines membranaires et solubles peuvent être identifiés par la combinaison de plusieurs méthodes de préparation et les techniques de séparation avec haute résolution spectrométrie de masse.
Abstract
La protéomique est une approche couramment utilisé qui peut fournir des informations dans les systèmes biologiques complexes. L'épithélium sensoriel cochléaire qui contient des récepteurs transduisent l'énergie mécanique de l'énergie sonore dans un électro-chimique traitées par les systèmes nerveux périphérique et central. Plusieurs techniques de protéomique ont été développés pour étudier l'oreille interne cochléaire, tels que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel de différence (2D-DIGE), des puces à anticorps, et la spectrométrie de masse (MS). MS est l'outil le plus complet et polyvalent en protéomique et en conjonction avec les méthodes de séparation peut fournir un protéome en profondeur des échantillons biologiques. méthodes de séparation combinés avec MS a la capacité d'enrichir les échantillons de protéines, de détecter de bas poids moléculaire et de protéines hydrophobes, et identifier des protéines de faible abondance par la réduction de la plage dynamique du protéome. Différentes stratégies de digestion peuvent être appliqués à tout ou lysat à fractionnée lysat protéique pour améliorer le peptide et la protéineune couverture de séquence. L'utilisation de différentes techniques de séparation, y compris l'échange de cations fort (SCX), en phase inverse (RP), et le liquide électrophorèse fraction de piégeage de gel-élué (GELFrEE) peut être appliquée pour réduire la complexité de l'échantillon avant l'analyse MS pour l'identification des protéines.
Introduction
La protéomique est l'étude des systèmes biologiques complexes par l'analyse de l'expression des protéines, la fonction, les modifications, et les interactions 1. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour l'analyse du protéome de l'oreille interne, y compris l'anticorps microarray 2, électrophorèse bidimensionnelle sur gel 3-5, et DIGE 6. Toutefois, seul un nombre limité de protéines ont été identifiées et caractérisées 2,7-10, par rapport aux plus de 10.000 gènes et des marqueurs de séquences exprimées (EST) identifiés dans l'oreille interne 11,12, MS est la technique la plus couramment utilisée complet et en protéomique pour la caractérisation des protéines. L'analyse des échantillons protéomiques complexes, comme la cochlée, peut être difficile. Cependant, la combinaison de plusieurs techniques de séparation avec MS permet l'identification d'un grand nombre de peptides et de protéines, en raison d'une gamme de concentration dynamique accrue et la capacité de pointe 13. Chroma multidimensionnellephie réduit mélanges de protéines très complexes en permettant l'utilisation de mécanismes d'adsorption différentes. Il existe deux approches de SEP d'analyse du protéome couramment utilisés, fusil de chasse et de la protéomique bottom-up. Dans la protéomique de fusil de chasse, un mélange de protéines intactes est digéré par voie enzymatique et on le sépare par chromatographie multidimensionnelle avec une Chromatographie d'échange de cations forte (SCX), puis par Chromatographie liquide en phase inverse (RPLC) 14,15. Les peptides séparés sont soumis à SM en tandem et base de données de recherche 15. Un avantage majeur de cette technique est que des milliers de protéines peuvent être identifiées dans une seule analyse et la technique convient mieux pour des protéines membranaires.
Dans l'approche du bas vers le haut, le mélange de protéines est séparé, généralement par une ou-électrophorèse bidimensionnelle, et les bandes de protéines individuelles ou des taches coupé et digéré avec une enzyme telle que la trypsine, ce qui entraîne habituellement en plusieurs peptides. Cependant, une autre plus récentement développé approche électrophorétique, utilisé en protéomique bottom-up, est GELFrEE. Cette technique fractionne les échantillons de protéines en phase liquide et les rend moins complexe avant l'analyse. Cette technique est reproductible, offre une récupération élevée en protéines, et de réduire la distribution des protéines abondantes élevés dans les échantillons de protéines complexes 16. Peptides, issus de protéines séparées, sont analysés par MS, en utilisant peptide empreinte de masse tandem ou MS (MS / MS), pour créer des étiquettes de séquence pour la base de données de recherche 17-19. Certains des principaux avantages de l'utilisation de l'approche bottom-up sont la capacité d'obtenir des séparations à haute résolution et une couverture complète de la protéine. protéomique bottom-up est la technique la plus largement utilisée en protéomique 20, donc, plusieurs outils bioinformatiques sont disponibles. En outre, les protéines peuvent être séparées dans un mélange complexe avant la digestion, il n'y a donc plus de chances d'identification.
L'un des principaux défisen utilisant l'oreille interne pour l'analyse protéomique est sa petite taille, l'accessibilité restreinte, et le type de cellule diversité 21. En outre, les protéines clés qui permettent de distinguer un fonctionnement, tels que les canaux ioniques, les transporteurs et les récepteurs, sont des protéines membranaires, qui peuvent être difficiles à isoler 22. Ainsi, la préparation de l'échantillon filtre assistée (FASP) est avantageux pour les analyses protéomiques de tissus qui sont limités pour l'extraction de protéines et qui nécessitent des détergents pour solubiliser les membranes 23. Ce filtrage permet l'analyse de membrane et des protéines solubles MS et pour la capacité à isoler des peptides à partir de contaminants de faible poids moléculaire 23,24.
Le présent protocole décrit des approches de protéomique couramment utilisés qui sont combinés et modifiés pour analyser les protéines solubles et membranaires et pour maximiser le nombre d'ID de protéine à partir de l'épithélium sensoriel cochléaire. Nous allons décrire en utilisant la protéomique de fusil de chasse avec FASP multi-digérerions, la chromatographie d'échange d'ions, SM à haute résolution, et l'analyse des données. En outre, nous allons décrire la protéomique bottom-up avec GELFrEE, FASP multi-digestion, SM à haute résolution, et l'analyse des données.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes clés pour maximiser l'identification des protéines à partir de l'épithélium sensoriel cochléaire sont: 1) l'utilisation de multiples endoprotéinases pour la digestion, 2) l'utilisation de techniques de séparation multiples, et 3) l'utilisation d'un spectromètre de masse à haute résolution. L'application de plusieurs enzymes augmente le nombre de peptides et améliore la couverture de la séquence de protéine, d'où l'amélioration du nombre de protéines …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Kent Seeley, directeur du Centre pour la découverte de médicaments et l'innovation (CDDI) Facility protéomique de base à l'Université de Floride du Sud pour l'utilisation de cette installation. Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCD subvention R01 DC004295 à BHAS
Materials
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm × 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
References
- Domon, B., Aebersold, R. Review – Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
- Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
- Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
- Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. . The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).
- Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
- Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
- Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
- Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. . Plos One. 6, (2011).
- Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
- Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
- Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
- Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
- Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
- Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
- Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
- Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down’ protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
- Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
- Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
- Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
- Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O’Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).
