Descriviamo un multi-angolo di rotazione imaging ottico del sistema (Maroi) in vivo quantificazione di un marcatore fluorescente consegnato da saposin C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Impiegando modelli murini di cancro e artrite, si dimostra come l'analisi della curva Maroi segnale può essere utilizzato per la mappatura precisa e caratterizzazione biologica dei processi patologici.
Descriviamo un multi-angolo di rotazione del sistema di imaging ottico (Maroi) per il monitoraggio in vivo di processi fisiopatologici marcati con un marcatore fluorescente. Modelli murini (tumore al cervello e artrite) sono stati usati per valutare l'utilità di questo metodo. Saposin C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles taggati con CellVue Maroon (CVM) fluoroforo sono stati somministrati per via endovenosa. Gli animali sono stati quindi posti nel supporto rotazionale (MARS) del sistema di imaging in vivo. Le immagini sono state acquisite in 10 ° passi oltre 380 °. Una regione rettangolare di interesse (ROI) è stato posto su tutta la larghezza dell'immagine presso il sito della malattia modello. All'interno del ROI, e per ogni immagine, intensità di fluorescenza media è stata calcolata dopo la sottrazione del fondo. In modelli murini studiati, i nanovesicles etichettati state riprese in entrambi i tumori cerebrali ortotopiche e transgeniche, e nei siti artritici (punte e caviglie). Analisi della curva dell'angolo più image ROI determinato l'angolo con il segnale più elevato. Così, l'angolo ottimale per l'imaging ogni sito malattia è stata caratterizzata. Il metodo Maroi applicata all'imaging di composti fluorescenti è uno strumento non invasivo, economico e preciso per l'analisi quantitativa in vivo degli stati di malattia nei modelli murini descritti.
Tutta la rappresentazione degli animali è diventato un potente strumento nello studio della fisiopatologia animale. Tra i sistemi di imaging attuali, MS PRO FX permette ai ricercatori di accuratamente etichettati dettagli di fluorescenza (o luminescenti) composti e / o tessuti nei topi viventi, e contemporaneamente ottenere immagini radiografiche. Con il sistema (MARS) recentemente introdotto multimodale rotazione animale un completo, la rotazione automatica del mouse è realizzata in modo da catturare sia fluorescente / luminescenti e immagini a raggi X ad angoli specifici 1. Acquisizione delle immagini può essere programmato in modo tale che immagine serie sequenziale può essere catturato a specifici angoli incrementali piccolo come 1 °. Questo permette di identificare l'orientamento ottimale dell'animale, cioè. quello in cui la distanza tra il segnale fluorescente / luminescenti generato internamente e dispositivo di rilevazione del sistema è il più corto. Questo, a sua volta, facilita il riposizionamento preciso dell'animale per l'imaging successiva séssions durante gli studi longitudinali.
In questo rapporto, descriviamo l'implementazione di un sistema multi-angolo di imaging ottico di rotazione (Maroi) in vivo quantificazione dell'intensità marcatore fluorescente. Maroi analisi della curva di segnale può essere utilizzato in studi longitudinali per correlazione diretta di distribuzione del segnale fluorescente per mappare con precisione i siti malate o processi biologici di interesse.
Questo sistema è stato utilizzato per monitorare l'assorbimento di fluorescente nanovesicles SAPC-DOPS da tumori ortotopiche e spontanei, nonché da foci artritici, nei topi vivente; forniva insiemi di dati multispettrali e multimodali derivati da copertura completa rotazione degli animali. Tra le numerose sonde fluorescenti attualmente disponibili per imaging in vivo, quelli che emettono nelle regioni spettrali nel vicino infrarosso e lontano-rosso conferisce l'interferenza minima con la pelle e tessuti, e forniscono la penetrazione e di immagine più alta risoluzioneolution. Abbiamo usato CellVue Maroon (CVM) 2,3, un linker lontano globuli rossi fluorescenti (Ex 647/Em 667), per etichettare SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12.
Determinazione accurata della posizione e grandezza dei tumori solidi e focolai infiammatori in condizioni reumatiche è fondamentale per attuare un adeguato trattamento e follow-up progressione della malattia o la remissione. Mentre, preziose strategie attuali di imaging (raggi X, risonanza magnetica, ultrasuoni, raggi X tomografia computerizzata) fornire valutazioni incomplete di stato della malattia. Ad esempio, il danno articolare artritico è comunemente valutata dai raggi X, che fornisce informazioni sulla struttura ossea ma non l'infiammazione dei tessuti molli e la distruzione, caratteristica dei primi stadi della malattia. Il metodo Maroi presentato qui unisce i vantaggi di entrambi i raggi X e sofisticate modalità di imaging dei tessuti molli (ad esempio MRI o ultrasuoni) in una piattaforma integrata, non invasiva e semplice che consente anche una mappatura completa in 3D e la ricostruzione del tessuto malato o organo in piccoli animali come topi.
Questo metodo sfrutta l'affinità selettiva of SAPC-DOPS nanovesicles per residui fosfatidilserina esposti, che sono abbondanti nelle membrane di cancro e cellule infiammatorie. Il determinante di questa associazione è SAPC, una proteina lisosomiale fusogenica con una forte affinità per i fosfolipidi anionici come fosfatidilserina 7,10,11. Quando coniugata con una sonda fluorescente (CVM), sistemica iniettato SAPC-DOPS possono essere ricondotte al tumore e siti artritici da imaging di fluorescenza.
Limiti del nostro metodo sono legati alla sua sensibilità, che attualmente limita l'uso di imaging di piccoli animali come topi. Come con altri metodi di imaging, segnale fluorescente ottimale di rumore è limitato dalle dimensioni del tumore o la portata di artrite, e può essere compromessa quando imaging di tessuti o organi, con fondo elevato (autofluorescenza) come orecchie (brain imaging), intestino / feci (di imaging addominale) e zampe (imaging arti posteriori). A questo proposito, abbiamo scoperto che un colorante rosso lontano come CVM profornisce una maggiore separazione risoluzione spettrale e nell'impostazione in vivo di altre sonde fluorescenti nella gamma visibile.
Altre insidie sono potenzialità del movimento dell'animale durante l'imaging, sia mentre anestetizzato e post mortem (rigor mortis). Posizionamento dell'arto posteriore, in particolare, è spesso difficile da stabilizzare per evitare movimenti durante la rotazione. Allo stato attuale della tecnica è anche molto tempo, con tempi di scansione fino a 60 minuti per completare una rotazione completa e acquisire immagini di alta qualità.
Il metodo Maroi presenta una serie di vantaggi rispetto ad altre modalità di imaging. La capacità di immagine tessuto malato da 38 (o più) diverse angolazioni permette la visualizzazione di fluorescenza che può essere ostacolato nel valutare da un unico piano; questo è prezioso in studi sugli animali perché può aiutare a minimizzare il numero di falsi negativi che derivano dalle immagini ad angoli inappropriati. Per OVERLying raggi X e immagini di fluorescenza, una precisa localizzazione anatomica della zona malata può essere determinato. Infine, la possibilità di vivere l'imaging (in vivo) consente studi longitudinali da eseguire.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH / NCI Grants Numero 1R01CA158372-01 (Qi) e New Drug State Key Project di Grant Numero 009ZX09102-205 (Qi). Assistenza Scrittura è stato fornito dal Dr. Judy Racadio, ed è stato finanziato dall'Università di Cincinnati Dipartimento di Ematologia e Oncologia. Vontz Nucleo Imaging Lab (VCIL) presso la Facolta 'di Medicina presso l'Università di Cincinnati.
Dulbecco's modified eagle medium | Gibco (Grand Island, NY) | 11965 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco (Grand Island, NY) | 16000077 | |
Penicillin-streptomycin | Hyclone (Logan, Utah) | SV30010 | |
Dioleoylphosphatidylserine | Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) | 840035C | |
CellVue Maroon | Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA) | C-1001 | |
Sephadex G25 column PD-10 | Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ) | 17-0851-01 | |
New Standard Stereotaxic for Rats and Mice | Harvard Apparatus (Holliston, MA) | 726335 | |
Bransonic Ultrasonic Cleaners Model 1510 | Branson Ultrasonics (Danbury,CT) | CPN-952-118 | |
Multi-spectral FX system | Bruker Corporation (Billerica, MA) | ||
Multi-angle Rotational Optical Imaging Device | Bruker Corporation (Billerica, MA) |