동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em> C. 엘레</em> 배아
Summary
이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.
Abstract
이 프로토콜은 예쁜 꼬마 선충 배아를 개발 내에서 세포를 분할 이미지 형광 현미경의 사용을 설명합니다. 특히,이 프로토콜은 표피 세포 아래에서 발견되어 표피 형태 형성을 위해 중요 할 수있다 neuroblasts을 분할하는 방법을 이미지에 초점을 맞추고 있습니다. 조직의 형성은 후생 동물의 개발에 매우 중요하고 주변 조직에서 외부 단서에 의존한다. C. 엘레은 현미경을 통해 공부의 조직이 쉽게 만들기 때문에 투명성과 간단한 조직에 생체 내에서 조직의 형태 형성을 연구하는 훌륭한 모델 생물이다. 복부 인클로저는 배아의 복부 표면 상피 세포의 단일 층에 의해 커버되는 과정이다. 이 이벤트는 위에있는 상피 세포의 이동을 중재하기 위해 화학 지침의 단서를 제공하는 기본 neuroblasts에 의해 촉진 될 것으로 생각됩니다. 그러나 neuroblasts 높게 증식 있고 작용할 수있다복부 표피 세포에 대한 기계적인 기질로. 이 실험 프로토콜을 사용하여 연구는 조직 형성 동안 세포 간 통신의 중요성을 발견 할 수 있고, 개발 조직 내 세포 분열에 관련된 유전자의 역할을 나타 내기 위해 사용될 수있다.
Introduction
어떻게 이미지의 세포 분열에 대한 초기 C.에 설명 프로토콜이 있지만 엘레 배아,이 프로토콜은 어떻게 이미지 세포 분열 중순 배아 동안 조직 내에서 설명합니다. 개발하는 동안 생물 이미징의 주요 과제 중 하나는 광독성에 대한 민감성이다. 그러나, 회전 디스크 공 촛점 현미경 또는 휩쓸 필드 현미경에 대한 접근성 향상은 더 광범위한 이미징 어플리케이션을 허용했다. 두 시스템은 생물체에 노출 된 UV의 레벨을 제한 고체 레이저 산란광을 사용한다. 그러나 위드 스탠드는 여전히 높은 감도 (예 : EMCCD), 조리개 제어 및 조명 제어 (예를 들어, LED가 또는 조정 수은 전구)와 카메라 등이 갖추어져 있습니다 특히 경우, 생체 내 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 C. 개발 내에서 이미지 세포 분열에 촛점 기반 시스템 또는 위드 시스템을 사용하는 방법에 대해 설명합니다 엘레 </ EM> 배아. 예를 들어, 우리는 어떻게 이미지 neuroblast의 세포 분열에 대해 설명합니다. Neuroblasts는 상부 표피 세포에 화학적 또는 기계적 신호를 제공하여 표피 형태 형성을 촉진하고, 조직의 형성, 세포 간 통신의 중요성의 좋은 예를 제공 할 수있다.
예쁜 꼬마 선충은 투명성과 간단한 조직의 조직 1에 의한 현미경 기반 연구를위한 이상적인 모델 생물이다. 또한, C. elegans의 유전 적 방법 및 RNAi의 의무이며, 그 유전자의 대부분은 인간 동족체를 갖기 때문에, 그것을 조직 형성 2-5 보존 메커니즘을 식별하는 데 사용될 수있다. C.에서 배아> 300 셀이 때의 elegans, 표피의 형성은, 중간 배 발생하는 동안 발생합니다. 표피의 형태 형성 배아가 수축 표피 세포의 레이어로 둘러싼 EMBR를 변환하는 확장하는 동안 몇 가지 주요 단계로 구성웜 (6)의 가늘고 긴 모양으로 타원형 형태에서 요. 복부 표피 세포가 태아의 복부 표면 (그림 1)을 커버하기 위해 복부 정중선으로 마이그레이션 할 때 복부 인클로저는, 이러한 형태 발생 이벤트 중 하나에 대해 설명합니다. 첫째, 전방에 위치한 리딩 엣지 세포 두 쌍은 반대편 이웃 6 복부가 준수 중간 선, 퓨즈를 향해 이동한다. 이것은 복부 포켓 6-7을 만드는 모양처럼 쐐기를 형성하는 후방에 위치한 포켓 세포의 이주가옵니다. 포켓을 닫 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 하나의 가능성은 supracellular 말라 마이 오신 수축 구조가 8 상처 치유와 유사한, 패션 등 지갑 문자열에 함께 포켓 세포를 묶는 것입니다. 흥미롭게도, 포켓 세포의 일부 마이그레이션 epidermi 아래에 발견되는 기본 neuroblasts 9 (신경 세포 전구체의 특정 부분 집합에 의해 매개된다의, 그림 1B).
이전 연구는 neuroblasts가. VAB-1 (Ephrin 수용체)와 VAB-2 (Ephrin 리간드)이 높은 neuroblasts로 표현하고 서로 전방 및 후방 neuroblasts의 정렬을 용이하게하는 복부 표피 세포의 이동 및 복부 인클로저를 조절하는 것으로 나타났다 및 VAB-1 또는 VAB-2 원인 복부 인클로저에 돌연변이가 10-13 표현형. 그러나 발기인 구조 실험 VAB-1도 neuroblasts 분비 다른지도 단서의 상부 복부 표피 세포 수용체에 필요하다는 것을 보여 주었다은 복부 표피 세포를 9로 표현된다. 이들 수용체의 돌연변이는 복부 인클로저 표현형을 야기하지만 결점 때문에 neuroblast 위치 또는 의한 지침에 응답하는 복부 표피 세포의 실패가 14 큐들에 문제가 발생하는 경우에는, 그것이 명확하지 않다. neuroblasts 위스콘신의 분할을 변경안내 신호를 분비 할 수있는 능력에 영향을 미치는 thout는 neuroblasts의 역할과 표피의 형태 형성 동안 기계적 입력을 제공 할 수있는 능력에 대해 설명해 주실 수 있습니다. 최근에는 세포 분열의 유전자, ANI-1 (anillin)가 높은 neuroblasts (그림 2A)로 표현하고 그 고갈 neuroblast 부문 결함의 원인이되는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도,이 배아는 복부 인클로저 표현형 (Fotopoulos, Wernike 및 Piekny, 게시되지 않은 관찰)을 표시합니다.
Anillin은 세포 분열에 필요한, 특히 어머니의 세포가 물리적으로 두 개의 딸 세포로 분할하는 과정을 설명 세포질 분열에 대한됩니다. 세포질 분열 긴밀 제대로 자매 염색 분체의 분리와 결합되도록 공간과 시간에서 제어 될 필요 actomyosin 수축 링의 형성에 의해 구동된다. 후생 동물 세포질 분열의 마스터 레귤레이터는 RhoA의 (C. elegans의에서 RHO-1) 인 작은 GTPase의입니다그 GTP-결합 형태 ctive. GEF Ect2/ECT-2는 RhoA의-GTP가 수축 고리를 형성하고 그 ingression 15 중재 하류 음향과 상호 작용 한 후, RhoA의 활성화됩니다. Anillin는 C-말단을 통해 그것의 N-말단을 통해 액틴과 미오신에 RhoA의에 결합하는 다중 도메인 단백질이다. Anillin는 포유 동물 초파리 S2 세포 (16)의 수축 링의 위치를 안정화하는 데 필요합니다. Anillin 고갈 측면 진동을 받아야 수축 반지의 원인과 세포질 분열은 결국 multinucleate 세포에게 17 ~ 19을 형성 실패합니다. 흥미롭게도, 비록 C. 엘레 ANI-1은 세포질 분열에 필수적인 아닌, 초기 배아에서 actomyosin의 수축을 조정합니다. 그러나, 전술 한 바와 같이, ANI-1은 중간 배아 (Fotopoulos, Wernike 및 Piekny, 게시되지 않은 관찰) 동안 neuroblast의 세포질 분열이 필요합니다. 세포질 분열 실패 neuroblasts의 개수와 위치를 변화시키는과 LOC에 영향을 미칠 수화학적 유도 큐 ATION 또는 그 조직의 기계적 특성을 변경할 수있다. 두 모델은 복부 인클로저 neuroblasts의 비 자립적 역할 및 배아 발달 동안 조직 – 조직의 의사 소통의 중요성을 강조.
이 실험 프로토콜을 설명하는 방법을 이미지 세포 분열을하는 동안 C. 엘레 형광 현미경을 이용하여 중간 배아. 세포 분열의 메커니즘을 연구 실험의 대부분은 세포의 제한된 수의 (예를 들면 C. 한 세포 배아, 제노, 또는 극피 동물 엘레 간스와 배양 접시 (예. 헬라 또는 S2 세포) 내에서 단일 세포 또는 초기 배아에서 수행 하였다 배아). 그러나, 분할면의 타이밍 및 배치에 영향을 미칠 수있는 외부 신호가로, 또한 조직 내 세포 분열을 연구하는 것이 중요하다. 또한, 세포는 주변 조직의 발달에 영향을 화학적 또는 기계적 신호를 제공 할 수있다의, 그리고 세포 간 통신을 개발하는 동안 형성하기 위해 조직을하는 데 도움이 방법을 이해하는 것이 중요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 중간 배아 발생 동안 화상 세포 분열에 대한 현미경의 각종 유형의 사용을 설명한다. 특히,이 프로토콜에서는 표피의 형태 형성을 촉진 할 수 neuroblasts의 분열, 세포를 이미지에 강조 표시합니다. 세포 – 세포 통신은 후생 동물 개발 및 C. 동안 조직 형성에 중요 엘레은 생체 내에서 조직 형성을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 잘 조직의 상호 작용을 묘사 한 이벤트는 상?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC) 부여 공학 연구위원회에 의해 지원되었다 있음을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
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