Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em> C. elegans</em> Embriogênese
Summary
Este protocolo descreve como as células em divisão imagem dentro de um tecido em Caenorhabditis elegans embriões. Embora vários protocolos descrevem como a divisão celular imagem no embrião precoce, este protocolo descreve como imagem divisão celular dentro de um tecido em desenvolvimento em meados embriogénese tardia.
Abstract
Este protocolo descreve a utilização de microscopia de fluorescência para a imagem a divisão das células dentro desenvolvendo Caenorhabditis elegans embriões. Em particular, este protocolo se concentra em como a imagem dividindo neuroblastos, que são encontrados debaixo das células da epiderme e podem ser importantes para epidérmica morfogênese. Formação de tecido é crucial para o desenvolvimento metazoan e depende de estímulos externos a partir de tecidos vizinhos. C. elegans é um excelente organismo modelo para estudar a morfogênese do tecido in vivo devido à sua transparência e organização simples, fazendo com que seus tecidos fáceis de estudar via microscopia. Invólucro ventral é o processo em que a superfície ventral do embrião é coberto por uma única camada de células epiteliais. Este evento é pensado para ser facilitado pelas neuroblastos subjacentes, que fornecem sinais de orientação química de mediar a migração das células epiteliais sobre jacentes. No entanto, os neuroblastos são altamente proliferativo e também podem agircomo um substrato mecânico para as células da epiderme ventral. Estudos utilizando este protocolo experimental pode descobrir a importância da comunicação intercelular durante a formação do tecido, e pode ser utilizada para revelar o papel dos genes envolvidos na divisão celular em tecidos em desenvolvimento.
Introduction
Embora existam protocolos que descrevem como a divisão celular imagem no início do C. elegans embrião, este protocolo descreve como a divisão celular imagem dentro de um tecido em meados embriogênese. Um dos maiores desafios em imagem organismos durante o desenvolvimento tem sido a sua sensibilidade a fototoxicidade. No entanto, o aumento da acessibilidade a fiação microscópios confocal disco ou microscópios de campo varreram permitiu aplicações de imagem mais difundida. Ambos os sistemas utilizam lasers de estado sólido e de luz difusa, o que limita os níveis de UV que os organismos são expostos. No entanto, estandes Widefield ainda pode ser usado para geração de imagens in vivo, particularmente se eles são equipados com câmeras com alta sensibilidade (por exemplo EMCCD), controle de abertura e controle de luz (por exemplo, LEDs ou lâmpadas de mercúrio ajustável). Este protocolo descreve como usar um sistema confocal base ou um sistema de campo amplo para a divisão celular imagem dentro desenvolvimento C. elegans </ Em> embriões. Como um exemplo, nós descrevemos como a imagem da divisão celular neuroblasto. Os neuroblastos podem facilitar epidérmico morfogénese fornecendo estímulos químicos ou mecânicos para as células epidérmicas sobrepostas, e fornecer um excelente exemplo da importância da comunicação intercelular para a formação dos tecidos.
Caenorhabditis elegans é um organismo modelo ideal para estudos baseados microscopia devido à sua transparência e organização do tecido simples 1. Além disso, C. elegans é passível de métodos genéticos e RNAi, e uma vez que muitos dos seus genes têm homólogos humanos, ele pode ser usado para identificar os mecanismos conservadas para a formação de tecido de 2-5. Em C. elegans formação da epiderme ocorre durante o meio embriogênese, quando o embrião tem> 300 células. Epidermal morfogénese consiste em várias fases principais durante os quais o embrião é colocado entre uma camada de células epidérmicas que se contraem e se estendem ao transformar o embryo de uma forma ovóide na forma alongada de um verme 6. Invólucro ventral descreve um desses eventos morfogenéticas, quando as células da epiderme ventral migrar em direcção à linha média ventral, para cobrir a superfície ventral do embrião (figura 1). Em primeiro lugar, dois pares de células anteriores localizado Leading Edge migrar para a linha média ventral, onde se aderem e se fundem com seus vizinhos contralateral 6. Esta é seguida pela migração de células de bolso posterior localizado, que formam cunha como formas criando uma bolsa ventral 6-7. O mecanismo que fecha a bolsa não é bem compreendida. Uma possibilidade é que uma estrutura contrátil actina miosina supracellular liga as células de bolso juntos em um cordão da bolsa como a moda, semelhante a cicatrização de feridas 8. Curiosamente, a migração de algumas das células de bolso é mediada por subconjuntos específicos de neuroblastos subjacentes 9 (precursores neuronais que são encontrados sob a epidermis, Figura 1B).
Estudos anteriores mostraram que os neuroblastos regular a migração das células da epiderme ventral e invólucro ventral. VAB-1 (receptor de Efrina) e VAB-2 (ligando de Efrina) são altamente expressas em neuroblastos e facilitar a separação do anterior e posterior neuroblastos um do outro, e mutações em vab-1 ou vab-2 causa recinto ventral fenótipos 10-13. No entanto, as experiências mostraram que o promotor de salvamento também é necessário vab-1 nas células da epiderme ventral sobrepostas e receptores para outras pistas de orientação secretadas pelas neuroblastos são expressos nas células da epiderme ventral 9. Embora as mutações em qualquer um desses receptores causar fenótipos gabinete ventral, não está claro se os defeitos surgem devido a problemas no posicionamento neuroblasto ou devido à falha das células epidérmicas ventrais para responder a orientação cues 14. Alterando a divisão de neuroblastos without afetando sua capacidade de secretar pistas de orientação poderia lançar luz sobre o papel de neuroblastos e sua capacidade de fornecer entrada mecânica durante epidérmica morfogênese. Recentemente, verificou-se que um gene de divisão celular, ani-1 (anillin) é altamente expressa em neuroblastos (Figura 2A) e a sua exaustão faz com defeitos divisão neuroblastos. Curiosamente, estes embriões exibir fenótipos gabinete ventral (Fotopoulos, Wernike e Piękny, observações não publicadas).
Anillin é necessário para a divisão celular e, particularmente, para a citocinese, a qual descreve o processo pelo qual uma célula mãe divide fisicamente em duas células filhas. Cytokinesis é impulsionada pela formação de um anel contrátil actomiosina, que precisa ser rigidamente controlado no espaço e no tempo para garantir que ele está corretamente juntamente com a segregação de cromátides irmãs. O regulador mestre de citocinese metazoan é RhoA (RHO-1 em C. elegans), uma pequena GTPase que é umctive em sua forma ligada a GTP. O GEF Ect2/ECT-2 ativa RhoA, após o qual RhoA-GTP interage com efetores downstream que formam o anel contrátil e mediam seu ingresso 15. Anillin é uma proteína do domínio de multi que se liga a RhoA, através do seu terminal C e a actina e miosina, através do seu terminal-N. Anillin é necessário para estabilizar a posição do anel contráctil, em células de mamíferos ou de Drosophila S2 16. Esgotamento Anillin provoca anéis contráteis a sofrer oscilações laterais e citocinese eventualmente falhar formando células multinucleadas 17-19. Curiosamente, apesar de C. elegans ani-1 Coordenadas actomiosina contratilidade no embrião inicial, isso não é essencial para a citocinese. No entanto, como descrito acima, é necessária uma ani-1 para neuroblastos citocinese durante meados de embriogénese (Fotopoulos, Wernike e Piękny, observações não publicadas). Falha Cytokinesis alteraria o número ea posição dos neuroblastos e poderia afetar o locção de pistas de orientação química, ou que poderiam alterar as propriedades mecânicas do tecido. Ambos os modelos destacam o papel não-autônomos de neuroblastos para o gabinete de ventral, ea importância da comunicação tecido-tecido durante o desenvolvimento embrionário.
Este protocolo experimental descreve como a divisão celular durante a imagem C. elegans meados embriogênese usando microscopia de fluorescência. A maioria dos ensaios que estudam os mecanismos de divisão celular foram realizados em células individuais dentro de pratos de cultura (p. ex. HeLa ou células S2) ou em embriões precoces, com um número limitado de células (por exemplo, C. elegans embrião de uma célula, de Xenopus, ou Echinoderm embriões). No entanto, é importante também para estudar a divisão celular nos tecidos, uma vez que existem sinais externos que podem influenciar o tempo e de colocação do plano de divisão. Além disso, as células podem fornecer pistas químicas ou mecânicas para influenciar o desenvolvimento do tecido vizinhos, e é importante para entender como comunicação intercelular ajuda para formar tecidos durante o desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve o uso de vários tipos de microscopia de divisões celulares imagem durante meados embriogénese. Em particular, este protocolo destaca como a imagem da divisão de neuroblastos, células que podem facilitar epidérmica morfogênese. Comunicação célula-célula é importante para a formação de tecidos durante o desenvolvimento de metazoários e C. elegans é um excelente modelo para estudar a formação de tecido in vivo. Um evento que retrata muito bem a interação de teci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer que este trabalho foi apoiado pelas Ciências Naturais e Council of Canada (NSERC) concessão de Pesquisa de Engenharia.
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
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