تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراءات تجريبية لتقييم تمايز الخلايا الجذعية بلازماوية في التصحيح باير الأسلاف من الخلايا الجذعية المشتركة، وذلك باستخدام التقنيات التي تنطوي على نظام مراقبة الأصول الميدانية بوساطة العزلة الخلية، ونقل الجينات الهيدروديناميكية، وتحليل تدفق مجموعات فرعية المناعة في التصحيح باير.
Abstract
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لتحليل قدرة الأسلاف المكونة للدم النقي لتوليد الخلايا الجذعية بلازماوية (PDC) في الأمعاء التصحيح باير (PP). وتنقيته من نخاع العظام من الفئران C57BL6 بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية ونقلها إلى المتلقي الفئران التي تفتقر إلى السكان PDC كبيرة في PP – الأسلاف المشتركة الخلايا الجذعية (ج طقم لو CD115 + + FLT3 CDPs، لين)، وفي هذه الحالة، Ifnar – / – استخدمت الفئران كما المتلقين نقل. في بعض الفئران، وقد تم فرض overexpression من وعامل نمو الخلايا الجذعية FLT3 يجند (Flt3L) قبل بالتبني نقل CDPs، وذلك باستخدام نقل الجينات الهيدروديناميكية (HGT) من Flt3L ترميز البلازميد. Flt3L من overexpression يوسع سكان العاصمة مصدرها نقل (أو الذاتية) الأسلاف المكونة للدم. في 7-10 أيام بعد نقل السلف، تميزوا pDCs التي تنشأ عن الأسلاف نقل adoptively من خلايا المتلقي علىأساس CD45 علامة التعبير، مع pDCs من CDPs نقل يجري CD45.1 + والمتلقين يجري CD45.2 +. تم تقييم قدرة CDPs نقلها إلى المساهمة في السكان PDC في PP والرد على Flt3L بواسطة التدفق الخلوي من PP تعليق خلية واحدة من الفئران المتلقية. هذه الطريقة يمكن استخدامها لاختبار ما إذا كان السكان السلف الأخرى قادرة على توليد PP pDCs. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النهج لدراسة دور العوامل التي من المتوقع أن تؤثر على التنمية PDC في PP، عن طريق نقل مجموعات فرعية السلف مع ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression المناسبة للعامل التنموية المفترضة و / أو عن طريق التلاعب السيتوكينات المتداولة عبر HGT . هذه الطريقة قد تسمح أيضا تحليل الكيفية التي تؤثر pDCs PP تردد أو وظيفة فرعية المناعية الأخرى في ذكر المكتب الصحفى. ومن المزايا الفريدة لهذا الأسلوب هو استخدام Ifnar – / – الفئران، والتي تظهر استنزاف شديد PP pDCs نسبة إلى نوع الحيوانات البرية، وبالتالي allowiنانوغرام إعادة تشكيل PP pDCs في غياب آثار الخلط من أشعة قاتلة.
Introduction
هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لتقييم ما إذا كانت الخلايا الجذعية الأسلاف المشتركة (CDPs) قادرة على التسبب في الخلية الجذعية بلازماوية (PDC) السكان في التصحيح باير (PP). وكان الهدف العام من استخدام هذا الأسلوب لتقييم التنظيم التنموية للpDCs في التصحيح باير (PP pDCs). وسبب هذا هو المهم هو أن pDCs PP تختلف عن pDCs وجدت في الأنسجة الأخرى، بما في ذلك نخاع العظام والدم والطحال، وبالتالي فإنه من غير الواضح ما إذا كان pDCs PP والسكان PDC الأخرى تنمويا و / أو ذات الصلة وظيفيا. على وجه التحديد، ومن المعروف على نطاق واسع pDCs لكونها نوع الرئيسي أنا إنترفيرون (الإنترفيرون) المنتجين داخل منظومة المكونة للدم، والاستجابة لتول مثل مستقبلات 7 و 9 (TLR7 / 9) عن طريق تحفيز إفراز الإنترفيرون السريع 1-3. ومع ذلك، pDCs PP تعاني من نقص في إنتاج النوع الأول الإنترفيرون ردا على TLR التحفيز ناهض 4،5. علاوة على ذلك، PP pDCs أيضا تختلف عن pDCs وجدت في نخاع العظام والطحال فيتتطلب إشارات من نوع I إنترفيرون (الإنترفيرون) مستقبلات (IFNAR1) أو الإنترفيرون يشير STAT1 جزيء لتنميتها و / أو تراكم 5. وقد اقترح هذه البيانات إمكانية أن آليات تنظيمية واضحة تحكم pDCs PP مقابل pDCs في الأجهزة الأخرى (مثل نخاع العظم والطحال) 5.
واستند الأساس المنطقي الذي أدى إلى تطوير هذا الأسلوب على التطورات الحديثة في فهم الخلايا الجذعية (DC) علم الأحياء. معظم، إن لم يكن كلها، DC مجموعات فرعية مستمدة من الأسلاف المكونة للدم التي تعبر عن FMS مثل التيروزين كيناز 3 مستقبلات (FLT3) 6-10، ولكن لا يقتصر DC التنمية إلى النخاعي الكلاسيكية والممرات اللمفاوية. على سبيل المثال، FLT3 + الأسلاف النخاعي المشتركة (CMPS، لين – IL-7R – هيئة السلع التموينية-1 – ج + CD34 + عدة FcγR الصغرى / -) تؤدي إلى CDPs (لين – ج طقم لو CD115 + + FLT3)، whicح تمييز الى مزيد من pDCs والبلدان النامية التقليدية (CDCS) 9،10. على النقيض من ذلك، FLT3 + الأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPS، لين – IL-7R + هيئة السلع التموينية-1 لو ج طقم الصغرى) في المقام الأول إلى تطوير pDCs 11. لذلك، تشير دراسات سابقة تنشأ من pDCs لا يقل عن 2 متميزة السكان الاصلية المكونة للدم تحت تنظيم Flt3L، على الرغم من أن تحليل نموذجي وقد يقتصر على نخاع العظم والطحال و / أو مجموعات فرعية PDC الدم. وبالتالي، فإن عدد سكان السلف (ق) التي يولد PP pDCs المطلوب التحقيق. وفهم أصول PP pDCs تسليط الضوء على ما إذا كانت مشاركة مسارات تنموية مشتركة مع السكان PDC أخرى، أو استخدام آليات متميزة خلال جيلهم في مؤتمر المندوبين المفوضين.
وهناك ميزة فريدة من النهج الموصوفة هنا هو استخدام الفئران التي تظهر نقص حاد في PP pDCs كمتلقين لنقل بالتبني من الأسلاف المكونة للدم. الفئران مع الجيناتحذف التشنج في ترميز الجين IFNAR1 (Ifnar – / – الفئران) أو STAT1 (STAT1 – / -) كشفت عن وجود استنزاف لافتة في PP pDCs 5. لذلك، توفر هذه السلالات بيئة التي يتم فيها تخفيض pDCs PP، مما يتيح نقل بالتبني الدراسات التي يتعين القيام بها في غياب الأنظمة الاجتثاث خلية قوية مثل أشعة قاتلة. وقوة إضافية من الطريقة المعروضة هنا هو استخدام نقل الجينات الهيدروديناميكية (HGT) لتحفيز كميات مرتفعة من تعميم Flt3L. هذا يوفر نهجا فعالة من حيث التكلفة للحث على Flt3L في الجسم الحي، مقابل حقن البروتين المؤتلف. وقد استخدمت العديد من الدراسات، بما في ذلك تلك الموجودة في مختبرنا، HGT للحث على كميات خلوى في مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية 5،12،13.
تقسيم العمل وظائف المناعة دقيقة بالنسبة للبلدان النامية هو من مصلحة كبرى في علم المناعة. على وجه الخصوص، pDCs وسطاء المهم التسامح عن طريق الفم والنظامية المضادة للفيروساتالاستجابات، ولكنها تظهر أيضا على المساهمة في التنمية واستمرار المناعة الذاتية والسرطان 14-17. سوف بروتوكول الموصوفة هنا تسمح الآليات التنموية التي تنظم PP pDCs أن يكون استكشاف أكثر اكتمالا. بالإضافة إلى ذلك، قد يسمح هذا النهج من الدراسات لتقييم وظيفة PP PDC، ويجوز تمديدها لفهم التنظيم وظيفة من السكان المناعية الأخرى داخل ذكر المكتب الصحفى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية نقل بالتبني وصفها المقررة في هذه الوثيقة مساهمة CDPs للسكان PP PDC في الفئران المتلقية التي تعاني من نقص في PP pDCs (على سبيل المثال Ifnar – / – الفئران). في التجارب في المستقبل، سيكون من المهم لتقييم إمكانات مجموعات فرعية السلف الأخرى في توليد pDCs PP، وبخاصة ما إذا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكاترة. اليكس Gelbard ويليم Overwijk لتقديم المشورة بشأن نقل الجينات الهيدروديناميكية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (AI098099، الرياح)، ومركز إم دي أندرسون للسرطان علم التخلق، ومركز أندرسون MD للالتهاب والسرطان (SSW)، وصندوق RE بوب سميث التعليم (الأعرج).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
