이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.
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방법 논문
조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 장 Peyer의 패치 (PP)에 plasmacytoid 수지상 세포 (PDC)를 생성하는 정제 조혈 전구 세포의 기능을 분석하는 방법을 자세히 설명합니다. 공통 수상 세포 전구 세포 (CDP가 린 - C-KIT LO CD115 + FLT3 +)을 FACS로 C57BL6 마우스의 골수로부터 정제 및 PP에서 상당한 PDC 인구 부족받는 마우스에 옮겼다,이 경우 IFNAR - / - 마우스는 전송받는로서 사용 하였다. 일부 마우스에서, 수상 세포 성장 인자 FLT3 리간드 (Flt3L)의 과발현 Flt3L-인코딩 플라스미드의 유체 역학적 유전자 전달 (HGT)를 사용하여, CDP가 전송 입양 이전에 시행되었다. Flt3L 과발현이 전송 (또는 내인성) 조혈 전구 세포에서 발생하는 DC의 인구를 확장합니다. 전구 전송 후 7-10일에서, 적응 적 전송 조상에서 발생 올라가고은에받는 사람의 세포를 구별했다전송 CDP가가 + CD45.1되는 사람과받는 사람이 CD45.2의 + 인에서 올라가고있는 CD45 마커 표현의 기초. PP의 PDC 인구에 기여하고 Flt3L에 대응하는 전송 CDP가의 능력을받는 마우스의 PP 단일 세포 현탁액의 유동 세포 계측법에 의해 평가 하였다. 이 방법은 다른 전구 인구 PDCS PP를 생성 할 수 있는지 여부를 테스트하는 데 사용될 수있다. 또한,이 접근법은 HGT 통해 순환 사이토킨을 조작하여 추정 발달 요인 및 / 또는 적절한 넉다운 녹아웃 또는 과발현으로 원종 서브 세트를 전송함으로써, PP에서 PDC 발달에 영향을 미칠 것으로 예측되는 인자의 역할을 조사하기 위하여 사용될 수있다 . 이 방법은 PP의 PDC는이 보호 프로파일의 다른 면역 하위 집합의 주파수 또는 기능에 미치는 영향을 분석 할 수있다. / - - 마우스, 심각하게 고갈 PP 올라가고 야생 형 동물에 대해, 따라서 allowi을 보여이 방법의 독특한 기능은 IFNAR의 사용이다치명적인 조사에서 교란 효과의 부재에있는 PP 올라가고의 NG의 재구성.
서론
여기서 우리는 일반적인 돌기 세포 전구 세포 (CDP가이) Peyer의 패치 (PP)의 plasmacytoid 돌기 세포 (PDC) 인구에 상승을 줄 수 있는지 여부를 평가하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법의 전반적인 목표는 Peyer의 패치 (PP의 PDC)에 올라가고의 개발 규제를 평가하는 것이었다. 이 중요한 이유는 PP의 PDC의 골수, 혈액, 비장 등 다른 조직에서 발견 올라가고 다른, 따라서 그것이 PP의 올라가고 및 다른 PDC의 인구가 발달 및 / 또는 기능적으로 관련 있는지 불분명하다는 것이다. 구체적으로 올라가고 널리 I는 수신자 같은 수용체 7 빠른 IFN 분비 1-3 9 (TLR7 / 9) 자극에 반응, 조혈 시스템 내에서 (IFN) 생산 인터페론의 주요 유형으로 알려져있다. 그러나, PP의 올라가고 내가 TLR 길항제 자극 4,5에 대한 응답으로 IFN 유형을 생산 부족합니다. 또한, PP 올라가고는 골수와 비장에서 발견 PDC의 다른입력 신호를 필요로하는 난 (IFN) 수용체 (IFNAR1를) 인터페론 또는 IFN은 개발 및 / 또는 축적 5에 대한 분자 STAT1 신호. 이러한 데이터는 별개의 규제 메커니즘은 다른 장기에 올라가고 대 PP의 PDC는 (예를 들어, 골수, 비장)
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프로토콜
기관 승인 마우스를 포함 여기에 설명 된 모든 실험 조작에 대해 사전에 취득해야합니다. 이들은 골수 전구 세포의 분리를위한 C57BL6 마우스의 사용을 포함, IFNAR - / - 입양 조혈 전구 세포의 이동 및 생체 내 사이토 카인의 과다 발현을위한 HGT의 사용에 대한받는 사람으로 마우스. 적절한 주거 및 동물 관리는 연구자 또는 기관에 의해 제공되어야한다. 또한, 기관 승인 유체 유전자 전달 (즉, 재조합 DNA 승인)에 사용 된 플라스미드를 위해 요구 될 수있다. 여기에 설명 된 연구는 UT MD 앤더슨 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 유체 역학 유전자 이동 (HGT)
이 단계는 생체 내 5 DC 확장을 위해 Flt3L 순환 유도하기 위해 CDP가의 입양 전송에 2 일이 전에 수행되어야한다. 홍보epare 적어도 5받는 사람 마우스 / 그룹.
- 효율적인 HGT을 달성하기 위해, 수신자 IFNAR의 혈관 - / - 마우스 (CD45.2의 +)은 5-10 분....
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결과
우리의 결과는 프로토콜 2와 3에 설명 된대로, 마우스 골수 세포에서 CDP가의 분리 (그림 1)에 대한 게이팅 전략을 보여줍니다. CDP가이 전체 골수 세포의 약 0.1 %를 포함하고, 약 4-6 × 104 CDP가 한 마우스로부터 단리 할 수있다. 입양 전송되면, CDP가이 올라가고 및 CDCS (10)로 분화.
CDP가의 FACS 정화 그림 1. 게이팅 전략. 골수 세포 C57BL6 마우스에서 수집되었다. 리니지 양성 세포는 계보 마커 (CD3, CD.......
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토론
(- / - 마우스 예 IFNAR) 설명 입양 전송 기술은 여기에 PP 올라가고있는 불충분받는 생쥐의 PP PDC 인구에 CDP가의 기여를 평가했다. 미래의 실험에서는, PP의 PDCS는 FLT3 + CLP를 파생 여부 특히, PP의 PDCS 생성에 다른 전구 서브 세트들의 전위를 평가하는 것이 중요 할 것이다. 이 질문은 PP의 올라가고는 PP 적립 5를위한 IFNAR-STAT1 신호에 고유 민감한 이유는 불분명하게 남아 있기 때문에 중요하다, 그리고 PP의 PDC의 다른 장기에 올라가고와 유사한 발달 단서를 수행합니다.
이론적으로,이 방법은 모든 기관에서 PDC 인구 부족 생쥐에서 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 전사 인자 E2-2, PDC "마스터 조절기"의 결핍 마우스 (즉, TCF4 - / - 마우스), 쇼 눈에 띄는 P.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 Drs에 감사드립니다. 유체 유전자 전달의 조언 알렉스 Gelbard와 빌렘 Overwijk. 이 작품은 NIH (AI098099, SSW), 암 후성 유전학의 MD 앤더슨 센터, 염증 및 암의 MD 앤더슨 센터 (SSW) 및 RE 바브 스미스 교육 기금 (HSL)에서 교부금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J | 잭스 | 664 | |
| B6. SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15ml 원뿔형 튜브 | BD Biosciences | 352095 | |
| 50ml 원뿔형 튜브 | BD Biosciences | 352070 | |
| 멸균 수술용 핀셋 | |||
| 멸균 소형 쌍 가위 | |||
| 멸균 대형 쌍 가위 | |||
| 40 &뮤; m 세포 여과기 | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μ m 세포 여과기 캡 튜브 | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC 용해 완충액 | Sigma | R7757 | |
| FACS 완충액 | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, 필터 멸균 | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| 염소 안티 쥐 IgG 마이크로 비즈 | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD 컬럼 | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| 쥐 안티 D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| 쥐 안티 CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| 쥐 안티 CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| 쥐 안티 CD11c | BD Biosciences | ||
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 ( PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-SCA-1 (PE. Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC. 싸이7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC. Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE. Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| 열 램프 | |||
| 마우스 억제 | |||
| 1 ml 주사기 | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G 바늘 (멸균) | Becton Dickinson | 305109 |
참고문헌
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-prod....
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