Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon
Summary
DNabT hücreleri periferal T-hücreleri arasında nadirdir; Bununla birlikte, belli olmayan lenfoid dokuda bol miktarda bulunmaktadır. Non-lenfoid doku DN T hücrelerini izole Zorluk patofizyolojik önemini kabul kapasitelerine rağmen fonksiyonel analizini engellemektedir. Bu murin böbreğinden yüksek derecede arıtılmış DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir protokol açıklar.
Abstract
Lenfoid olmayan dokulardan DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol, çeşitli immün yanıtların onların daha çok rapor katılımı rağmen bulunmamaktadır. DN T hücreleri Allotransplantlar 1-6 bağışıklık ve oto-bağışıklık yanıtlarını ve tolerans düzenlenmesinde implike edilmiştir özel bir immün hücre türüdür. DN T-hücreleri, periferik kan ve sekonder lemfoid organlarda (dalak ve lenf düğümleri) nadir, ancak, fakat normal böbrekte önemli sakinleri vardır. Çok az nedeniyle çevrede kendi azlığı onların patofizyolojik işlevi 7 hakkında bilinmektedir. Biz son zamanlarda sürekli halde ve iskemi reperfüzyon yaralanması esnasında böbrek 8'de bu nüfusun kapsamlı bir fenotipik ve fonksiyonel analiz nitelendirdi. DN T hücresi işlevinin analizi büyük ölçüde böbrek kendi izolasyon için bir protokol geliştirilerek artırılacaktır.
Burada, biz isolatio sağlayan bir roman protokol açıklarMurin böbrekten oldukça saf ab CD4 + CD8 + T hücreleri ve T hücre DN n. Kısaca, biz kollajenaz kullanılarak böbrek doku sindirmek ve yoğunluk gradyanı ile böbrek mononükleer hücreleri (KMNC) izole. Bu KMNC den% 70 'den% 3 hematopoietik T hücreleri zenginleştirmek için iki aşama takip eder. İlk adım, CD45 + izolasyon kiti kullanılarak hematopoietik hücrelerin pozitif seçim oluşur. İkinci aşamada, DN T hücreleri negatif CD4, CD8 ve MHC sınıf II monoklonal antikorlar ve CD1d α-GalCer tetramer kullanılarak olmayan arzu edilen hücreler ayrılmasıyla izole edilmektedir. Bu strateji,% 90'dan fazla saf DN T hücre popülasyonu yol açar. , FACS analizi ile, ardından yukarıda belirtilen antikorlar ile lekeleme yüzey saflığını teyit etmek için kullanılır.
Introduction
Periferik αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – double-negatif (DN) T hücreleri fenotip ve işlevlerini 1-4 sahip çeşitli tiplerin ayrılır. DN T hücreleri, tam olarak anlaşılamamıştır, fakat çok daha farklı hastalık modellerinde 4-6 patofizyolojik bağışıklık tepkilerine dahil edilmektedir.
DN T hücrelerinin artan çeşitli bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesi ve allotransplant tolerans modülasyonunda rol benzersiz bir bağışıklık hücresi bir türüdür. 4-6, 9 Bunlar dalak ve lenf düğümleri (periferal kan ve sekonder lemfoid organlarda nadirdir .) Ancak, normal böbrek ve bağırsak epitel 10-12 önemli sakinleri vardır. Çok az kararlı halde böbrekte işlevlerine yaklaşık 7 ve böbrek transpl ile bağlantılı akut böbrek hasarı (AKI) gibi patolojik koşullar altında bilinirkarınca.
Çünkü her oyuncunun rolünü tanımlayan, alloresponses de dahil olmak üzere bağışıklık tepkilerini düzenleyen farklı bağışıklık hücrelerinin karmaşık rolleri alloresponses anlamak ve yeni terapötik tasarımı önemlidir. Ve fizyolojik koşullar altında, farklı hastalık, böbrekte bulunan DN T hücrelerinin önemli sayıda göz önüne alındığında, DN T hücreleri transplant alıcılarında kritik farelerde ve insanlarda bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkileri düzenlenmesinde bir rol oynayabilir ve alloresponses muhtemeldir. Hala dağınık delil olsa Biriken hem patojenik ve bağışıklık fonksiyonları DN T hücrelerini implicates ama neden ve nasıl belli bir zararlı ya da baskılayıcı fonksiyonunu sergilemek ve çevre onları nasıl etkilediğini de anlaşılamamıştır.
Nedeniyle böbrekte düşük bolluğu nedeniyle, izolasyon geliştirilmiş yöntemler gerekmektedir.
T DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol bulunmamaktadıro non-lenfoid dokular. Bizim protokol böbrekten DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif eder; Bununla birlikte, yöntem, aynı zamanda, çeşitli lenfoid olmayan dokular için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tür otoimmün hastalıklar, kanser, graft tolerans ve akut böbrek hasarı (AKI) da dahil olmak üzere böbrek hastalıkları, birincil olarak farklı patolojik koşullarda karıştıktan çünkü DN T hücrelerinde artan bir ilgi vardır, 8, 13, glomerülonefrit. Bu nedenle, daha iyi bir DN T hücrelerinin patofizyolojik fonksiyonları ve karakterize etmek için bir ihtiyaç vardır. Ancak, şu anda CD4 ve CD8 T hücreleri ile karşılaştırıldığında, bu hücrelerin fonksiyonu içinde anlayışında…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH PBS (R21 AI095484) tarafından desteklenmektedir. Biz CD1d tetramerin NHI tetramerdir çekirdek tesis ederiz.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
