Isolering av Double Negative αβ T-celler från njure
Summary
DNabT celler är sällsynta bland perifera T-celler; Men, de är rikligt förekommande i vissa icke-lymfoida vävnader. Svårighet att isolera DN T-celler från icke-lymfatisk vävnad hindrar deras funktionella analyser trots ökande erkänd patofysiologiska betydelse. Vi beskriver en roman protokoll för isolering av höggradigt renade DN T-celler från mus njure.
Abstract
Det finns idag inget standardprotokoll för isolering av DN T-celler från icke-lymfvävnad trots deras alltmer rapporterade engagemang i olika immunsvar. DN T-celler är en unik immun celltyp som har varit inblandad i regleringen av immun och autoimmuna svar och tolerans till allotransplants 1-6. DN T-celler är dock sällsynt i perifert blod och sekundära lymfoida organ (mjälte och lymfkörtlar), men är viktiga invånare i normal njure. Mycket lite är känt om deras patofysiologiska funktion 7 på grund av deras brist i periferin. Vi beskrev nyligen en omfattande fenotypiska och funktionsanalys av denna befolkning i njuren 8 i stabilt tillstånd och under ischemireperfusionsskada. Analys av cellfunktionen DN T kommer att förstärkas avsevärt genom att utveckla ett protokoll för deras isolering från njuren.
Här beskriver vi ett nytt protokoll som tillåter isolation av mycket rena ab CD4 + CD8 + T-celler och DN T-celler från mus njure. Kortfattat, smälta vi njurvävnad med hjälp av kollagenas och isolera njurmononukleära celler (KMNC) genom densitetsgradient. Detta följs av två steg för att berika hematopoietiska T-celler från 3% till 70% från KMNC. Det första steget består av en positiv selektion av hematopoietiska celler med användning av CD45 + isoleringskit. I det andra steget, är DN-T-celler negativt isoleras genom avlägsnande av icke-önskade celler med användning av CD4, CD8 och MHC klass Il-monoklonala antikroppar och CD1d α-GalCer tetramer. Denna strategi leder till en befolkning på mer än 90% ren DN T-celler. Ytfärgning med ovan nämnda antikroppar följt av FACS-analys används för att bekräfta renheten.
Introduction
Perifera αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – dubbel-negativ (DN) T-celler är uppdelade i olika undergrupper som besitter olika fenotyper och funktioner 1-4. DN T-celler är dåligt känd, men i allt högre grad inblandad i patofysiologiska immunsvar i olika sjukdomsmodeller 4-6.
DN T-celler är en unik immun celltyp som i allt högre grad är inblandad i regleringen av olika immun och autoimmuna reaktioner och moduleringen av allotransplantat tolerans. 4-6, 9 De är sällsynta i perifert blod och sekundära lymfoida organ (mjälte och lymfkörtlar ). Men de är stora bosatta i normala njurar och tarm epitel 10-12. Mycket lite är känt om deras funktion 7 i njuren i stabilt tillstånd och under patologiska tillstånd såsom akut njurskada (AKI) i samband med njur Transplmyra.
På grund av de invecklade roller olika immunceller i reglering av immunsvar, inklusive alloresponses, fastställa uppgifterna för varje spelare är avgörande för att förstå alloresponses och design av nya läkemedel. Med tanke på de betydande antal DN T-celler som finns i njuren under fysiologiska och olika sjukdomstillstånd, DN T-celler kommer sannolikt att spela en viktig roll i regleringen av immun och autoimmuna reaktioner hos möss och människor, och alloresponses hos transplantationspatienter. Ackumulerande men fortfarande spridda bevis blandar in DN T-celler i både patogena och immunosuppressiva funktioner, men det är dåligt förstått varför och hur de uppvisar en viss skadlig eller undertryckande funktion och hur miljön påverkar dem.
På grund av deras låga förekomst i njure, förbättrade metoder för isolering är nödvändiga.
Det finns idag inget standardprotokoll för isolering av DN T-celler från than icke-lymfoida vävnader. Vårt protokoll beskriver ett nytt förfarande för isolering av DN-T-celler från njure; emellertid kan förfarandet också användas för olika icke-lymfoida vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns ett ökat intresse för DN T-celler eftersom de håller på att blandas in i olika patologiska tillstånd såsom autoimmuna sjukdomar, cancer, graft tolerans, och primära sjukdomar i njure inklusive akut njurskada (AKI), glomerulonefrit 8, 13. Därför finns det behov av att bättre förstå och karaktärisera de patofysiologiska funktioner DN T-celler. Men för närvarande finns det en brist på förståelse för dessa cellers funktion jämfört med CD4-och CD8-T-celler. En viktig orsak är brist …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH PBS (K21 AI095484). Vi tackar NHI tetramer core facilitet för CD1d tetramer.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
