लाइव प्राथमिक कोशिकाओं में G3BP तनाव granules गतिशीलता के दृश्य
Summary
तनाव granules (एसजीएस) ठप Ribonucleoprotein कणों (RNPs), और विभिन्न तनाव सेलुलर प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण युक्त cytoplasmic शाही सेना कणिकाओं हैं. एसजीएस के गतिशीलता तनाव के बाद ट्रांसफ़ेक्ट प्राथमिक कोशिकाओं में एसजीएस की एक में चिह्नित घटक के स्थानीयकरण visualizing द्वारा जीवित कोशिकाओं में पीछा किया जा सकता.
Abstract
एसजीएस विशिष्ट प्रोटीन घटकों या Pólya + mRNAs का immunostaining के द्वारा कोशिकाओं में देखे जा सकते हैं. एसजीएस अत्यधिक गतिशील हैं और उनके विधानसभा और भाग्य का अध्ययन करने के लिए तनाव सेलुलर प्रतिक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. G3BP (RasGAP SH3 डोमेन बंधनकारी प्रोटीन) की तरह एसजीएस के प्रमुख कारकों में कमी चूहों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के परिवर्तन में विकास संबंधी दोषों की ओर जाता है. एक जीव, एक कर सकते संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं से कोशिकाओं में एसजीएस की गतिशीलता का अध्ययन और एसजीएस के एक ट्रांसफ़ेक्ट में चिह्नित घटक के स्थानीयकरण का पालन करें. हम माउस भ्रूणीय fibroblasts में G3BP1 युक्त एसजीएस (MEFs) का निरीक्षण करने के लिए समय चूक प्रयोग का वर्णन है. इस तकनीक को भी यह हाल ही में इन एसजीएस अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative रोगों की शुरुआत में गठन कर रहे हैं कि दिखाया गया था के रूप में जो महत्वपूर्ण है, जी न्यूरॉन्स में G3BP युक्त एसजीएस अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण किसी भी अन्य सेलुलर शरीर और दाना प्रोटीन घटक के लिए अनुकूलित, और किया जा सकता हैट्रांसजेनिक जानवरों के साथ, इन कणिकाओं की एक विशिष्ट कारक के अभाव में उदाहरण के लिए कणिकाओं की गतिशीलता का जीना अध्ययन की अनुमति.
Introduction
तनाव granules (एसजीएस) ऐसे ऊंचा तापमान, oxidative तनाव, हाइपोक्सिया, आसमाटिक झटका, यूवी विकिरण, ग्लूकोज अभाव, या वायरल संक्रमण 1 के रूप में पर्यावरण तनाव, एक सेलुलर रक्षात्मक प्रतिक्रिया के रूप में गठन गैर झिल्लीदार cytoplasmic foci हैं. वे oxidative तनाव से चलाता है जो सोडियम आर्सेनाइट, जैसे यौगिकों के साथ इलाज के द्वारा रासायनिक प्रेरित किया जा सकता है. एसजीएस ठप अनुवाद गिरफ्तार दूत Ribonucleoprotein (mRNPs) जमा translational मशीनरी से mRNAs sequestering, 2 परिसरों, और उनके विधानसभा eIF2α की phosphorylation (यूकेरियोटिक दीक्षा कारक 2 α) द्वारा शुरू किया जा सकता है. एसजीएस पी निकायों की तरह polysomes और अन्य granules के साथ घटकों का आदान जो गतिशील संरचनाओं हैं. वे mRNAs हल और स्थिर गैर polysomal mRNPs 3 में अनुवाद, reinitiation, गिरावट, या पैकेजिंग के लिए या तो कार्रवाई की जाती है, जहां एक "ट्राइएज केन्द्र" का गठन. एसजीएस के विधानसभा तेजी ख हैकेन्द्र शासित प्रदेशों यह बड़ा granules में संगठित होना जो प्रारंभिक कई छोटे समुच्चय के साथ एक क्रमिक प्रक्रिया है. सूक्ष्मनलिकाएं बाधित या स्थिर कि रासायनिक inhibitors का उपयोग microtubule नेटवर्क विधानसभा, एकीकरण और disassembly प्रक्रियाओं सहित एसजी गतिशीलता के लिए आवश्यक है कि पता चलता है.
एसजीएस के गतिशील विधानसभा भी TIA -1 (टी सेल आंतरिक प्रतिजन -1) और जैसे विशिष्ट शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (आरएनए बीपी) के एकत्रीकरण द्वारा पदोन्नत किया है TIAR dimerize करने में सक्षम हैं जो (TIA-1 से संबंधित प्रोटीन), और एसजीएस 4 में polysome disassembly और mRNAs का मार्ग बढ़ावा देने. G3BP (RasGAP SH3 डोमेन बाध्यकारी प्रोटीन) कोशिकाओं आर्सेनाइट या उच्च तापमान के साथ जोर दिया जाता है, और dephosphorylated G3BP की overexpression एसजीएस विधानसभा 5 पैदा कर सकते हैं जब एसजीएस localizes कि इस तरह के एक शाही सेना बी.पी. है.
G3BP शुरू में RasGAP पी (एक रास GTPase सक्रिय प्रोटीन के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से होती थी कि एक evolutionarily संरक्षित आरएनए बी.पी. है120 6); लेकिन इस बातचीत हाल ही में 7 पर दोबारा गौर किया गया. G3BP परिवार दो स्तनधारियों में सदस्यों, G3BP1 (G3BP के रूप में) और G3BP2 8 शामिल है. कोशिकाओं तनाव 9 के अधीन हैं जब दोनों प्रोटीन, एसजीएस में colocalize. विहित आरएनए मान्यता आकृति (RRM) संरक्षित RNP1 और RNP2 रूपांकनों के साथ: G3BPs एक एन टर्मिनल NTF2 डोमेन प्रोलाइन अमीर (PxxP) रूपांकनों द्वारा पीछा उनके स्थानीयकरण और oligomerization, प्रभावित करने के लिए सुझाव शामिल है, तो सी टर्मिनल रूपांकनों शाही सेना बाध्यकारी के साथ जुड़े , एक arginine-ग्लाइसिन अमीर (RGG) बॉक्स के द्वारा पीछा किया. दिलचस्प है, EGFP के लिए जुड़े हुए अलग डोमेन के निर्माण से प्रोटीन के विभिन्न भागों का विश्लेषण NTF2 तरह डोमेन और शाही सेना बाध्यकारी डोमेन सबसे अधिक कुशलता से dimerization के गुणों के महत्व का सुझाव दे, एसजीएस के लिए भर्ती और शाही सेना में बाध्यकारी थे कि पता चला एसजीएस के विधानसभा. विभिन्न मॉडल विट्रो 10-13 में G3BP प्रोटीन के विभिन्न कार्यों से पता चला है.चूहों में G3BP के विघटन विकास विकास और अस्तित्व के 14, साथ ही स्थानिक काम स्मृति 15 में गतिभंग और दोषों के द्वारा होती केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में G3BP के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका में इस प्रोटीन का महत्व पता चला है. G3BP कमी एसजी गठन और neurodegenerative रोगों 15 के बीच सीधा संबंध स्थापित करने, बदल neuronal plasticity और कैल्शियम homeostasis की ओर जाता है. यह न्यूरॉन्स की तरह प्राथमिक कोशिकाओं में एसजीएस की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सक्षम होने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है.
इस प्रोटोकॉल आर्सेनाइट उपचार के तहत प्राथमिक कोशिकाओं में G3BP1 युक्त एसजीएस के विधानसभा निरीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. यह तनाव का उदाहरण विभिन्न प्रकार के अलग अलग परिस्थितियों में एसजीएस विधानसभा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी एसजीएस के अन्य कणिकाओं या अन्य घटकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. दरअसल, इस प्रोटोकॉल G3BP1 पर केंद्रित है, लेकिन TIA-1 / आर, टीटीपी (tristetraprolin) 2 की तरह अन्य तनाव granules मार्कर कर रहे हैंFMRP (नाजुक एक्स मानसिक मंदता सिंड्रोम प्रोटीन) 16, तेदेपा -43 (transactive प्रतिक्रिया डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन 43) 17 या Staufen 18. विशेष रूप से, TIA-1 / आर की तरह प्रोटीन overexpressed जब अलग गठन एसजीएस समारोह, विनियमन और एसोसिएटेड टेप में अलग कर सकते हैं, भले ही, एसजीएस विधानसभा प्रेरित कर सकते हैं कि शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन nucleating, G3BP तरह, कर रहे हैं. एसजीएस के इन प्रमुख घटकों में से किसी एक या nucleators की fluorophore टैग संस्करण के अभिकर्मक छवि विशेष एसजीएस विधानसभा और गतिशीलता के लिए किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल चिंता अभिकर्मक और ध्यान से cytotoxicity नीचे कम करने के क्रम में निरीक्षण किया जा रहा है जो अधिक विशेष रूप से समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण में सबसे महत्वपूर्ण कदम है.
प्राथमिक कोशिकाओं क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों अधिग्रहण प्रदर्शन किया गया जहां मोंटपेलियर रियो इमेजिंग (एमआरआई) मंच स्वीकार करना चाहते हैं. वे प्रोटोकॉल के विभिन्न भागों में उनकी मदद के लिए इसाबेल क्रिस्टीना लोपेज Mejia, एलेक्जेंड्रा मेट्ज़, इरीना Lassot, Solange Desagher, फेबियन Loustalot, और वर्जीनी Georget धन्यवाद. इस काम ला Recherche médicale (एफ आर) (Equipe एफ आर एम 2011-n ° DEQ20111223745) Fondation से बहना का समर्थन किया था.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
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