Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen
Summary
Stress-Granulat (DMS) sind zytoplasmatische RNA Granulat installiert Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) und in der zellulären Antwort auf verschiedene Belastungen wichtig enthalten. Dynamik der SGs können in lebenden Zellen durch die Visualisierung der Lokalisation einer markierten Komponente von SGs in transfizierten primären Zellen nach Stress verfolgt werden.
Abstract
SGs in Zellen durch Immunfärbung von spezifischen Proteinkomponenten oder polyA + mRNAs visualisiert werden. SGs sind sehr dynamisch und die Untersuchung ihrer Montage und Schicksal ist wichtig, um die zelluläre Reaktion auf Stress zu verstehen. Der Mangel an Schlüsselfaktoren der SGs wie G3BP (RasGAP SH3-Domäne Binding Protein) führt zu Entwicklungsstörungen bei Mäusen und Veränderungen des zentralen Nervensystems. Um die Dynamik von SGs in Zellen aus einem Organismus, man kann Kultur primären Zellen zu untersuchen und folgen Sie der Lokalisierung eines transfizierten markierten Komponente der SGs. Wir beschreiben Zeitraffer-Experiment zu beobachten G3BP1 haltigen SGs in embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF). Diese Technik kann auch verwendet werden, um G3BP enthaltenden DMS in lebenden Neuronen zu untersuchen, die von entscheidender Bedeutung ist, wie es vor kurzem gezeigt, dass diese SGs sind beim Einsetzen von neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit, gebildet werden. Dieser Ansatz kann auf jeden anderen Zellkörper und Granulat Proteinkomponente angepasst und durchmit transgenen Tieren, so dass die Live-Studie von Granulaten Dynamik zum Beispiel in der Abwesenheit eines spezifischen Faktors dieser Granulate.
Introduction
Stress Granulate (SGs) nicht membranöse zytoplasmatischen Foci als zelluläre Schutz Reaktion auf Umweltstress, z. B. erhöhte Temperatur, oxidativer Stress, Hypoxie, osmotischen Schock, UV-Bestrahlung, Glukoseentzug oder virale Infektion 1 gebildet. Sie können chemisch durch Behandlung mit Verbindungen wie Natriumarsenit, die oxidativen Stress auslöst, induziert werden. SGs akkumulieren installiert Übersetzung verhaftet Messenger ribonucleoprotein (mRNPs)-Komplexe 2, Maskierungs mRNAs von der Translationsmaschinerie und deren Montage kann durch die Phosphorylierung von eIF2a (eukaryotische Initiationsfaktor α 2) ausgelöst werden. SGs sind dynamische Strukturen, die Komponenten mit den Polysomen und andere Granulate, wie die P-Gremien auszutauschen. Sie bilden eine "Triage-Zentrum", wo mRNAs werden sortiert und entweder für Übersetzung, Reinitiierung, Abbau oder Verpackung in stabilen, nicht-polysomaler mRNPs 3 verarbeitet. Die Montage ist schnell SGs but ist es ein schleichender Prozess mit Anfangs zahlreiche kleine Aggregate, die in größere Körnchen zusammenwachsen. Die Verwendung von chemischen Inhibitoren, die stören oder Mikrotubuli stabilisieren zeigt, dass das Mikrotubulus-Netzwerk für SG Dynamik einschließlich Montage und Demontage Koaleszenz Verfahren erforderlich sind.
Die dynamische Anordnung von SGs auch durch Aggregation von spezifischen RNA-bindenden Proteinen (RNA-BP) wie TIA-1 (T-Zell-Antigen-Innen 1) und gefördert TIAR (TIA-1-verwandtes Protein), die in der Lage sind, zu dimerisieren und zu fördern Polysom Demontage und das Routing von mRNAs in SGs 4. G3BP (RasGAP SH3-Domäne-bindendes Protein) ist ein solches RNA-BP, die SGs lokalisiert, wenn die Zellen mit Arsenit oder Hochtemperatur betont, und die Überexpression von dephosphoryliert G3BP können SGs Anordnung 5 induzieren.
G3BP ist eine evolutionär konservierte RNA-BP, die zunächst durch die Interaktion mit einem Ras-GTPase-aktivierendes Protein gekennzeichnet war (p RasGAP120 6); aber diese Wechselwirkung wurde vor kurzem überarbeitet 7. Die Familie G3BP zwei Mitglieder bei Säugetieren, G3BP1 (als G3BP genannt) und G3BP2 8. Beide Proteine co-lokalisieren in SGs, wenn die Zellen auf Stress 9 unterzogen. Den kanonischen RNA-Erkennungsmotiv (RRM) mit konservierten RNP1 und RNP2 Motive: G3BPs umfassen eine N-terminale Domäne NTF2 vorgeschlagen, um ihre Lokalisation und Oligomerisierung, gefolgt von Prolin-reiche (PxxP) Motive zu beeinflussen, dann C-terminalen Motive mit RNA-Bindung verbunden durch eine Arginin-Glycin reichen (RGG) Feld gefolgt. Interessanterweise ist die Analyse der verschiedenen Teile des Proteins durch Konstruktion verschiedener Domänen EGFP fusioniert zeigte, dass die NTF2-ähnliche Domäne und die RNA-Bindungsdomäne waren die effizient SGs rekrutiert, was auf die Bedeutung der Eigenschaften der Dimerisierung und RNA-Bindung in die Montage der SGs. Diverse Modelle haben unterschiedliche Funktionen von Proteinen in vitro G3BP 10-13 offenbart.Unterbrechung G3BP in Mäusen haben die Bedeutung dieses Proteins in der Entwicklungs Wachstum und Überleben 14, sowie eine wichtige Rolle für G3BP in das zentrale Nervensystem (ZNS), von Ataxie und Defekte in der räumlichen Arbeitsspeicher 15 gekennzeichnet dargestellt. G3BP Mangel führt zu veränderten neuronalen Plastizität und Calcium-Homöostase und stellt eine direkte Verbindung zwischen SG Bildung und neurodegenerative Erkrankungen 15. Es ist daher wichtig, um die Dynamik der SGs in primären Zellen wie Neuronen zu studieren.
Dieses Protokoll bietet einen einfachen Weg, um die Montage von G3BP1 haltigen SGs in primären Zellen unter Arsenit Behandlung zu beobachten. Es kann verwendet werden, um DMS Anordnung unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, zum Beispiel verschiedene Arten von Spannungen werden. Es kann auch zu anderen Granulaten oder anderen Bestandteilen der SGs angepasst werden. Tatsächlich konzentriert sich dieses Protokoll auf G3BP1, aber es gibt andere Stress Granulat Marker wie TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein-Syndrom) 16, TDP-43 (transaktiven Reaktion DNA-bindendes Protein 43) 18 17 oder Staufen. Insbesondere Proteine wie TIA-1 / R sind wie G3BP, Keim RNA-bindende Proteine, die SGs Montage induzieren kann, wenn überexprimiert wird, auch wenn die verschiedenen geformt SGs in Funktion, Regulation und zugehörigen Transkripte unterscheiden. Transfektion von Fluorophor-markierte Version eines dieser Schlüsselkomponenten oder Nucleatoren von SGs können, um bestimmte Bild SGs Montage und Dynamik durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte im Protokoll betreffen die Transfektion und insbesondere der Zeitraffer-Akquisitionen, die sorgfältig, um weiter unten die Zytotoxizität überwacht werden müssen.
Kultur von Primärzellen ist nicht eine schwierige Teil, solange sterilen Bedingungen eingehalten werden und Vorsicht, um Schäden während der Präparation und Zelldissoziation Schritte zu verhindern. MEFs kann in frühen Passagen eingefroren werden. Neuron Transfektion mit Calciumphosphat wurde gezeigt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Montpellier Rio Imaging (MRI)-Plattform, wo die Übernahmen wurden durchgeführt, zu bestätigen. Sie danken Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot und Virginie Georget für ihre Hilfe in verschiedenen Teilen des Protokolls. Diese Arbeit wurde von der Fondation la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745) unterstützt gießen.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
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