Summary
En beskrivelse av hvordan man skal kalibrere Förster Resonance Energy Transfer integrerte biologiske sensorer (fibs) for in situ metabolske profilering er presentert. De FIBS kan brukes til å måle intracellulære nivåer av metabolitter invasivt hjelpe til med utviklingen av metabolske modeller og høy gjennomstrømning screening bioteknologi forhold.
Abstract
I den æra av beregningsorientert biologi, nye high throughput eksperimentelle systemer er nødvendig for å fylle og avgrense modeller slik at de kan testes ut for prediktive formål. Ideelt slike systemer ville være lite volum, noe som utelukker sampling og destruktive analyse når tidsforløpet av data som skal innhentes. Det som trengs er en in situ overvåking verktøy som kan rapportere nødvendig informasjon i sanntid og ikke-invasivt. Et interessant alternativ er bruk av fluorescerende, protein-basert in vivo biologiske sensorer som journalister av intracellulære konsentrasjoner. En spesiell klasse av in vivo biosensorer som har funnet programmer i metabolitt kvantifisering er basert på Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom to fluorescerende proteiner forbundet med en ligandbindende domene. FRET integrerte biologiske sensorer (fibs) er konstitutivt produsert innenfor cellelinjen, de har rask responstid og deres spektrale chaegenskaper endres basert på konsentrasjonen av metabolitten i cellen. I dette papir, er metoden for å konstruere kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinjer som konstitutivt uttrykker et FIBS for glukose og glutamin, og kalibrering av FIBS in vivo i batch cellekultur for å muliggjøre fremtidig kvantifisering av intracellulær konsentrasjon metabolitt beskrevet. Data fra fødesats-CHO-cellekulturer viser at FIBS var i stand til i hvert tilfelle for å detektere den resulterende forandring i den intracellulære konsentrasjon. Ved hjelp av det fluorescerende signalet fra FIBS og den tidligere konstruert kalibreringskurve, ble den intracellulære konsentrasjon nøyaktig bestemt som bekreftet ved en uavhengig enzymatisk assay.
Introduction
Metabolitt overvåking har ulike programmer i bioprocessing, inkludert prosessutvikling, media og fôr design, og metabolske engineering. Forskjellige metoder er tilgjengelige for konsentrasjonsmålinger ved bruk av en enzymatisk, kjemisk 2 eller bindingsanalyser 3. Et interessant alternativ er bruk av fluorescerende, protein-basert in vivo biologiske sensorer som journalister av den intracellulære konsentrasjonen av viktige metabolitter. I ultra-lavt volum assays, er fluorescens et passende verktøy som miniatyrisering faktisk forbedrer signal-til-støy-forhold 4,5 og protein-baserte sensorer kan være genetisk kodet betyr at ingen eksogene reagenser som er nødvendige for metabolitt-analyse. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensorer består av to selvlysende proteiner forbundet med en ligandbindende domene. FRET er en nonradiative overføring av energi fra en foto-glade giver til et mottaker fluorescerende molekyl belig ed i umiddelbar nærhet (<100). Ligand spalting eller binding fører til en konformasjonsendring i sensoren, som i sin tur induserer en forandring i nærhet av fluoroforer, som fører til en endring i FRET effektivitet målt ved endringen i emisjonsspektrum. FRET integrerte biologiske sensorer (fibs) blir konstitutivt produsert i cellelinjen, og deres spektrale egenskaper endres avhengig av konsentrasjonen av metabolitten i cellen. FIBS har rask responstid som gjør dem ideelle for å ta målinger for dynamiske modeller seks. Tidligere søknader omfatte overvåking enkelt 7-9 og flere 10 metabolitter og gi data om tid og rom fordeling 11. FIBS kan lages i to konfigurasjoner: Apo-Max, hvor ligandbinding forstyrrer nærhet av fluoroforene senke energioverføring og Apo-Min, hvor ligandbinding bringer de to fluoroforene i nærmere kontakt (figur 1).
_content "> I dette arbeidet er en protokoll presenteres for bygging av kinesisk hamster eggstokk (CHO) cellelinjer som konstitutivt uttrykker en FIBS for en metabolitt, glukose eller glutamin. En metode er etablert for kalibrering av sensoren in vivo for å muliggjøre fremtidige kvantitative målinger av intracellulært metabolitt konsentrasjon, som vist i figur 2.. Basert på dette, den intracellulære konsentrasjon av glukose eller glutamin kan bestemmes i fed-batch-CHO-cellekulturer, i hvilken de to næringsstoffer ble tilsatt i høye konsentrasjoner i-prosess. Resultatene viser at ved bruk av det fluorescerende signalet fra FIBS og den tidligere konstruert kalibreringskurve, er det mulig nøyaktig forutsigelse av den intracellulære konsentrasjon, som bekreftet ved en uavhengig enzymatisk assay. Denne fremgangsmåte gir betydelige fordeler i forhold til nåværende analytiske teknologi, fordi den er ikke-invasiv og lave kostnader og raskt, noe som gir et sanntidssignal av FIBS som kan være maskall overvåkes gjennom hele kulturen.Protocol
Representative Results
Discussion
De FIBS aktivere in vivo og in situ kvantifisering av viktige molekyler, i dette tilfelle vekstbegrensende næringssalter, fjerne usikkerheter som skyldes quenching og utvinningsmetoder. Resultatene tyder på at det er en god korrelasjon mellom FIBS signal og de intracellulære konsentrasjoner i området fra 1 til 5 mM for glukose og 0,3 til 2 mM for glutamin. I batch CHO cellekultur, er disse konsentrasjonene oppstått i den eksponentielle, stasjonære, og tidlig nedgang faser. Den eksponensielle og s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) for vennlig å gi oss med glukose FRET plasmid og Dr. Uwe Ludewig (Hohenheim University) for vennlig forsyne glutamin FRET konstruere i pUTKan anlegget uttrykk vektor. AB er finansiert av BBSRC Målrettet Prioriterte Studentships program. Både CK og KP støttes av RCUK Fellowships i Biopreparater Processing. CK ønsker også å takke Lonza Biologics for sin økonomiske støtte. Senter for Syntetisk biologi og innovasjon er sjenerøst støttet av EPSRC.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
