Misurare gli effetti dei batteri su<em> C. Elegans</em> Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell'uovo
Summary
Un uovo-in-worm (EIW) saggio è un metodo utile per quantificare la deposizione delle uova comportamento. Alterazioni nella deposizione delle uova può essere una risposta comportamentale del modello di organismo<em> Caenorhabditis elegans</em> A sostanze ambientali potenzialmente nocivi come quelli prodotti da batteri patogeni.
Abstract
C. elegans comportamento di deposizione delle uova è influenzato da stimoli ambientali come osmolarità 1 e vibrazioni 2. In totale assenza di cibo C. elegans cessano anche ovodeposizione e conservano le uova fecondate nel loro utero 3. Tuttavia, l'effetto di diverse fonti alimentari, in particolare i batteri patogeni e in particolare Enterococcus faecalis, sul comportamento ovodeposizione non è ben caratterizzata. L'uovo-a-vite senza fine (EIW) saggio è uno strumento utile per quantificare gli effetti di diversi tipi di batteri, in questo caso E. faecalis, il comportamento di deposizione delle uova.
Saggi EIW coinvolgono contando il numero di uova trattenuto nell'utero di C. elegans 4. Il saggio EIW coinvolge lo sbiancamento in scena, gravido adulto C. elegans per rimuovere la cuticola e separare le uova trattenuti dal animale. Prima di sbianca, vermi sono esposti a batteri (o qualsiasi tipo di stimolo ambientale) Per un determinato periodo di tempo. Dopo lo sbiancamento, uno è molto facilmente in grado di contare il numero di uova trattenuti all'interno dell'utero dei vermi. In questo saggio, un incremento quantificabile in ritenzione di uova dopo la E. esposizione faecalis può essere facilmente misurato. Il saggio è un saggio EIW comportamentale che può essere usato per individuare batteri potenzialmente patogeni o la presenza di tossine ambientali. Inoltre, il saggio EIW può essere uno strumento per lo screening per i farmaci che influenzano neurotrasmettitore segnalazione dal comportamento di deposizione delle uova è modulato da neurotrasmettitori come la serotonina e acetilcolina 5-9.
Introduction
Caenorhabditis elegans, un microscopico, nematodi a vita libera, è un organismo modello tradizionalmente utilizzato per lo studio dello sviluppo delle cellule e dei processi di segnalazione per la sua anatomia trasparente, sviluppo ben caratterizzato, completamente sequenziato genoma, la generazione in tempo breve, e omologia genetica per l'uomo . Più recentemente, C. elegans è diventato un organismo modello nel campo della tossicologia ambientale e di immunità innata 10, 11.
Questi auto-fertilizzanti vermi ermafroditi diventano sessualmente maturi entro due o tre giorni di cova dall'uovo. Durante il suo ciclo di vita, C. elegans passa attraverso quattro stadi larvali (L1-L4), prima di raggiungere l'età adulta. Un isolato ermafrodita in grado di produrre, in media, 300 prole entro tre giorni di picco di fecondità. In riproduttivamente maturo C. elegans ermafroditi, uova fecondate vengono mantenuti all'interno dell'utero per diverse ore prima di essere licenziati. Glinormale numero di uova memorizzati in utero in qualsiasi momento (durante l'alta fecondità) è tra i dieci ei quindici 12. Il numero di uova in utero è funzione sia del tasso di produzione di uova e il tasso di deposizione. Uova fecondate vengono espulsi dall'utero dalla contrazione dei muscoli sedici vulval disposti intorno all'apertura della vulva 13. Motoneuroni Ermafrodito-specifici (HSN di) e motoneuroni VC sinapsi sui muscoli vulvari influenzano la contrazione muscolare e quindi la deposizione delle uova comportamento 5,7,13,14. Espulsione di uova dal dell'utero si verifica a causa di attività coordinata dei neuroni e muscoli.
Culture Lab di C. elegans sono allevati con una dieta di non patogeno Escherichia coli OP50. In ambiente naturale, C. elegans entrano in contatto con una varietà di fonti di cibo, come batteri patogeni, che possono essere potenzialmente dannosi. Quando esposti a sostanze nocive inl'ambiente, C. elegans conservano le uova fino a quando l'ambiente diventa più favorevole. Presumibilmente questo ritenzione uovo è uno sforzo per proteggere la loro progenie.
In questo uovo a vite senza fine (EIW) saggio, C. elegans sono esposti ai batteri potenzialmente patogeni, Enterococcus faecalis, che si trova nell'ambiente. L'esposizione a forme patogeni di E. faecalis possono causare infezione intestinale persistente e persino la morte in C. elegans 15. Esposizione ad altre forme di batteri patogeni hanno mostrato di influenzare la ritenzione dell'uovo 16,17, tuttavia l'effetto non è stato quantificato. Inoltre, l'effetto di lieve patogeni ceppi di E. faecalis, i ceppi che non sono immediatamente letale, sul comportamento delle uova non è stato studiato.
Saggi EIW coinvolgono contando il numero di uova trattenuto nell'utero di C. elegans 4. Anche se C. eleganssono trasparenti, le uova si accumulano in utero possono essere difficili da quantificare in un animale intatto. Il saggio EIW coinvolge lo sbiancamento gravido adulto C. elegans che sono stati esposti ai batteri per un determinato periodo di tempo. La soluzione di candeggina scioglie la cuticola esterna lasciando dietro di sé le uova. Le uova sono refrattiva agli effetti della candeggina per la presenza di un guscio protettivo. Dopo sbianca, uno è molto facilmente in grado di contare il numero di uova rilasciate dall'utero dei vermi su di imbianchimento.
Il saggio descritto è un metodo semplice, economico e rapido per quantificare il numero di uova in utero in una sola volta, e quindi quantificare gli effetti di E. faecalis sulla ritenzione dell'uovo. Il test può essere utilizzato per quantificare l'effetto di altri tipi di batteri, tossine ambientali o farmaci sulla ritenzione uovo. Questa analisi ha anche il potenziale per essere utilizzato come schermo per la patogenicità batterica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi più critiche eseguire con successo questo saggio sono: 1) utilizzando grammature ben nutriti di C. elegans, 2) coltivazione di singoli tipi di batteri sulla piastra saggio, 3) identificare accuratamente messo in scena L4 vermi per l'esposizione a E. faecalis, 4) tenere il tempo di esposizione a E. faecalis coerente in tutte le prove e le 5) Tempo di sbiancanti non dovrebbe superare i dieci minuti per evitare la disintegrazione uovo.
Per questo dosaggio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare giugno Middleton per la fornitura di E. ceppi faecalis e di orientamento con coltura batterica. C. elegans sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dal NIH Ufficio Programmi di un'infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).
Materials
| Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
| Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
| Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
| C. elegans, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Culture plates for C. elegans | Tritech Research Inc. | T3308 | |
| Culture plates for E. faecalis | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| E. faecalis strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
| by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
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all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux). |
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| Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
| Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
| Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
| Yeast extract | Acros | 61180-1000 |
References
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