마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관
Summary
자궁 – 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 – 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다.
Abstract
대리 여성에게 착상 전 배아의 전송은 성적인 변경의 효과는 이후의 태아 발달과 성인의 건강에 착상 전 개발 과정에서 발생한 연구하는 유전자 변형 마우스 또는 생산을위한 필수 단계입니다. 효과적이고 일관된 배아 전송 기술의 사용은 유전자 변형 동물의 생성을 향상시키고 주입 속도와 용어 생존에 다른 치료의 효과를 결정하기 위하여 중요하다. 배반포 단계의 배아는 일반적으로 배아 조작 피펫을 소개하는 자궁 벽에 구멍을 수행, 자궁 전송에 의해 전송됩니다. 피펫이 철회 된 후 자궁에서 수행 구멍이 닫히지 않습니다, 인해 자궁의 긍정적 인 압력에 복강에 배아 수 유출. 천자는 또한 주입을 손상 출혈을 생성 블록 전송 피펫 및 배아 D에 영향을 미칠 수 있습니다조나없이 배아가 전송 특히 evelopment. 따라서,이 기술은 종종 매우 변수 및 전반적인 낮은 배아 생존율가 발생합니다. 이러한 부정적인 효과를 방지, 자궁 – 난관 배아 전송 배아의 유출을 막는 자연 장벽 자궁 – 난관 접합을 활용하여 자궁 벽의 구멍을 피하십시오. 과 vasectomized 남성은 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 정관 수술을 수행 할 수있는 기술은 자궁 – 난관 배아 전송에 대한 보완 설명되어 있습니다.
Introduction
배아 전송 아마 마우스 모델에서 수행되는 가장 흔한 수술입니다. 이 기술은 시험 관내 조작 기술을 실시 배아에서 자손을 구하는 것이 필수적이며, 따라서, 전핵 주입, 렌티 바이러스 형질 도입, 또는 키메라 형성에 의해 유전자 변형 된 모델의 개발에 필요한 단계를 구성한다. 또한,이 기술은 착상 전 개발 과정에서 발생하는 다양한 모욕의 개발 효과에 대한 연구를 할 수 있습니다. 인공 재생 기술 한 또는 상이한 물질 또는 대사 2의 비정상적인 농도에 노출의 사용은 주입 또는 태반 장애 및 자손 장기 효과의 결과 배아 발달에 영향을 미칠 수있다. 신뢰성 및 재현성 배아 전송 기술은 일관된 남자 주입 및 태아 발달에 실험적 치료 가능한 부정적 영향을 시험하는 데있어 매우 중요NER.
쥐의 착상 전 배아는 0.5 일 포스트 교미의 ampullae (DPC) pseudopregnant받는 사람 (난관 전송) 3.4 또는 2.5의 DPC pseudopregnant받는 사람의 자궁 (자궁 전송) 5,6를 통해 난관에 하나를받는 여성에 전송 될 수 자신의 발달 단계에 따라 달라집니다. 예컨대 배아 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포를 주입하여 키메라 생쥐를 생성하기 위해 사용되는 것과 같은 포배기 배아에서는, 보통 자궁 전송함으로써 전송된다. 배반포는 0.5 DPC받는 사람의 난관에 전송 될 수 있지만, 배아 주입이 발생하기 전에 모욕 복구에 2 일이 휴면을 거치고 있기 때문에 그것은, 발달 장애 물질에 대한 덜 생리적 테스트를 구성한다. 자궁 입금 자궁 내강으로 배아 조작 피펫의 액세스를 허용하는 개구를 생성하기 위해 좁은 바늘 자궁벽을 천공 포함한다.lthough이 기술은 좋은 결과를 얻을 수 있습니다, 용어 생존 (즉, 강아지에 개발 이전 배아의 비율)는 종종 낮은 7,8 예측할 수있다.
자궁 벽의 구멍은 어떤 해로운 부작용을 수반한다. 먼저, 근육층은 매우 혈관 조직이며 천자 종종 작은 출혈 초래한다. 혈액은 배아 전송 피펫을 차단하거나 배아 사망 및 / 또는 주입 실패의 원인이되는 자궁 내강에 침입 할 수 있습니다. 혈액 세포와 파편이 할구에 연결할 수 소나없이 배아가 전송되는 경우에 특히 적합합니다. 배아가 전송 된 이후에 두 번째로, 수행 개구는 밀봉되지 않기 때문에, 그들은 오리피스를 역류하고 너무 큰 부피 자궁에 도입되었을 때 복강으로 추방 될 수있다. 설명 자궁 – 난관 배아 전송이 여기에 EMBR을 제공하기 위해 자궁 – 난관 접합을 활용자궁벽을 천공함으로써 그 불리한 결과 구를 피할 필요없이 자궁 YOS.
배아 전송에 사용되는 pseudopregnant받는 여성은 남성과 vasectomized 8 자연 교배에 의해 얻을 수있다. 불임 남성에 의해 생성 된 정액 분비는 전송 된 배아를 수용하게됩니다 자궁 필요합니다. 받는 사람을 얻으려면 세 6 개월 8 주 2 여성의 최대 값은 오후에과 vasectomized 남성으로 배치됩니다. 다음 날 아침, 여성은 질 성교 마개, 남성의 정액에서 응고 단백질의 덩어리의 존재를 확인합니다. 정합은 보통 자정 중에 발생할 때, 질 플러그 검출의 일 0.5 DPC 것으로 간주된다. 과 vasectomized 남성은 일부 업체에서 구입 할 수 있지만, 여기에 기술 된 수술은 비교적 간단하고 배아 전송에 필요 이상으로 추가 장비가 필요하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
정관 수술은 큰 어려움을 포함하지 않는 비교적 똑 바른 앞으로 수술 기법이다. 포비돈 요오드와 에탄올로 소독하는 경우는 복막을 자극 할 수 있으므로 (에탄올) 마지막 세척, 포비돈 요오드를 제거해야합니다. 정관에 프리 또한 음낭 또는 복부 8 횡 절개를 수행함으로써 달성 될 수있다. 음낭 절개로 인해 필요한 비교적 작은 절개를하고 조금 더 나은 수술 후 행동 (11) 복?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 BT에 대한 동물 및 조류 과학학과에서 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Micro dissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8. |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used, they made narrower drops. |
References
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