Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Summary

Wir beschreiben eine Anordnung von Experimenten Ansatz, der verwendet werden kann, um festzustellen und das Modell des Einflusses der Transregulationselemente, Pflanzenwachstum und Entwicklung Parameter und Inkubationsbedingungen für die vorübergehende Expression von monoklonalen Antikörpern und Reporter-Proteine ​​in Pflanzen auf.

Abstract

Pflanzen bieten mehrere Vorteile für die Produktion von Biopharmazeutika mit niedrigen Kosten, Skalierbarkeit und Sicherheit. Die transiente Expression bietet den zusätzlichen Vorteil der kurzen Entwicklungs-und Produktionszeiten, sondern Expressionsniveaus erheblich zwischen den Chargen so was zu rechtlichen Bedenken im Rahmen der guten Herstellungspraxis variieren. Wir verwendeten eine Versuchsplanung (DOE) Ansatz, die Auswirkungen der wichtigsten Faktoren wie regulatorische Elemente in dem Expressionskonstrukt, das Pflanzenwachstum und Entwicklung Parametern und den Inkubationsbedingungen während der Expression, auf die Variabilität der Expression zwischen den Chargen zu bestimmen. Wir untersuchten Pflanzen ein Modell Anti-HIV-Antikörper (2G12) und einen fluoreszierenden Marker-Protein (DsRed) ausdrückt. Wir diskutieren die Gründe für die Auswahl bestimmter Eigenschaften des Modells zu identifizieren und ihr Potenzial Einschränkungen. Das allgemeine Konzept kann leicht auf andere Probleme übertragen werden, da die Prinzipien des Modells einwieder breit anwendbar: wissensbasierte Parameterauswahl, Komplexitätsreduktion durch Aufteilung der anfängliche Problem in kleinere Module, Software-geführte Installation der optimalen Experiment Kombinationen und schrittweise Design Augmentation. Daher ist die Methode nicht nur nützlich für die Charakterisierung der Proteinexpression in Pflanzen, sondern auch für die Untersuchung von anderen komplexen Systemen fehlt eine mechanistische Beschreibung. Die Vorhersagegleichungen zur Beschreibung der Interkonnektivität zwischen Parameter können verwendet werden, um mechanistische Modelle für andere komplexe Systeme aufgebaut werden.

Introduction

Die Produktion von biopharmazeutischen Proteinen in Pflanzen ist vorteilhaft, da Pflanzen kostengünstig zu wachsen, kann die Plattform sich nur durch den Anbau von Pflanzen mehr skaliert werden, und menschliche Krankheitserreger sind nicht in der Lage zu ^1,2 replizieren. Transiente Expressionsstrategien zum Beispiel auf Basis der Infiltration von Blättern mit Agrobacterium tumefaciens bietet zusätzliche Vorteile, da die Zeit zwischen dem Punkt der DNA-Zufuhr und die Abgabe eines gereinigten Produktes von Jahren auf weniger als 2 Monate ³ reduziert. Transiente Expression ist auch für die funktionelle Analyse, z. B. verwendet werden, um Gene, die für ihre Fähigkeit zur Ergänzung Verlust-Funktion Mutanten oder Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen ^4-6 testen. Allerdings neigen transiente Expressionsniveaus größere Charge zu Charge Variation als Expressionsniveaus in transgenen Pflanzen ^7-9 zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass biopharmazeutische Fertigungsprozesse basierend auf transiente Expression wiwerde im Rahmen der guten Herstellungspraxis (GMP) genehmigt werden, weil die Reproduzierbarkeit ist ein kritischer Qualitätsmerkmal und unterliegt Risikobewertung ^10. Solche Variation können auch alle Interaktionen, die Forscher wollen untersuchen, zu maskieren. Deshalb machten wir uns auf die wichtigsten Faktoren, die transiente Expression in Pflanzen zu beeinflussen und eine hochwertige quantitative Vorhersagemodell zu bauen identifizieren.

Das Ein-Faktor-at-a-time (OFAT)-Ansatz wird oft verwendet, um die Auswirkungen (Wirkung) bestimmter Parameter (Faktoren) auf das Ergebnis (Antwort) eines Experiments ¹¹ charakterisieren. Aber das ist nicht optimal, weil die einzelnen Tests (läuft) während einer Untersuchung (Experiment) werden wie Perlen auf einer Schnur durch die Potentialfläche durch die Faktoren, die getestet (design space) werden aufgespannt ausgerichtet werden. Die Abdeckung des Bauraums und somit den Grad der Informationen aus dem Experiment abgeleitetenniedrig, wie in Fig. 1A ¹² gezeigt. Ferner können Abhängigkeiten zwischen verschiedenen Faktoren (Faktor-Wechselwirkungen) verborgen bleiben, was zu schlechter Modelle und / oder der Vorhersage falsch Optima, wie in 1B ¹³ gezeigt.

Die oben beschriebenen Nachteile können durch Verwendung eines Versuchsplanung (DOE) Methode, bei der die Durchläufe eines Experiments sind mehr gleichmäßig über den Entwurfsraum verstreut, was bedeutet, dass mehr als ein Faktor zwischen zwei Läufen ¹⁴ variiert vermieden werden. Es gibt spezielle Ausführungen für Mischungen, Screening Faktoren (Faktoren-Modelle) und die Quantifizierung der Auswirkungen auf Faktor Antworten (Response Surface Methoden, RSM s) ^15. Weiterhin kann RSMs als zentrale Verbund Designs realisiert werden, sondern kann auch wirksam durch Verwendung spezieller Software, die Kriterien für die Auswahl der Läufe gelten erzielt werden. Beispielsweise die sogenannten D-optimality Kriterium läuft so zu wählen, um den Fehler in den Koeffizienten des resultierenden Modells zu minimieren, während die IV-Optimalitätskriterium wählt Läufe, die die niedrigste Vorhersage Varianz in der gesamten Entwurfsraum ^15,16 zu erreichen. Der RSM beschreiben wir hier ermöglicht die genaue Quantifizierung von transienten Proteinexpression in Pflanzen, aber es kann problemlos an jedes System mit mehreren (~ 5-8) übertragen werden numerische Faktoren (zB Temperatur, Zeit, Konzentration) und ein paar (~ 2 – 4) categoric Faktoren (z. B. Promotor, Farbe), in dem eine mechanistische Beschreibung ist nicht verfügbar oder zu komplex, zu modellieren.

Die DoE-Ansatz entstand in den Agrarwissenschaften, hat aber auf andere Bereiche ausgebreitet, weil es zu jeder Situation, wo es sinnvoll ist, die Anzahl der Durchläufe notwendig, um verlässliche Daten zu erhalten, verringern und Beschreibungsmodelle für komplexe Prozesse übertragbar. Dies wiederum hat zur Aufnahme von DoE in der "Anleitung für LED-Industrie, Q8 (R2) Pharmaceutical Development "von der Internationalen Konferenz zur Harmonisierung der technischen Anforderungen an die für die Registrierung von Humanarzneimitteln (ICH) ¹⁷ veröffentlicht. DoE wird heute weitgehend in der wissenschaftlichen Forschung und der Industrie ¹⁸ verwendet. Allerdings muss darauf während genommen werden die Planung und Durchführung des Experiments, weil die Auswahl eines falschen Polynomgrad für die Multiple-linearen Regressionsmodell (Basismodell) eine Notwendigkeit für zusätzliche Fahrten, um alle Effekte richtig zu modellieren Faktor einzuführen. Außerdem beschädigte oder fehlende Daten zu erzeugen falsche Modelle und fehlerhaft Vorhersagen, und kann sogar verhindern, dass Modellbildung Versuch wie in den Protokoll-und Diskussionsabschnitte ¹⁸ beschrieben. In der Protokollabschnitt, werden wir zunächst die wichtigsten Planungsschritte für eine RSM-basierten Versuchs und dann erklären, das Design auf der Grundlage des DoE Software DesignExpert v8.1. Aber ähnliche Designs lassen sich mit anderen Software-includi gebaut werdenng JMP, Modde und STATISTICA. Die experimentellen Verfahren werden von Anweisungen für die Datenanalyse und Auswertung folgt.

Fig. 1 ist. Vergleich von OFAT und DoE. A. Sequential Variation eines Faktors zu einer Zeit (OFAT) in einem Experiment (schwarz, rot und blau Kreise) erreicht eine geringe Abdeckung der Designraum (schraffierte Regionen). Im Gegensatz dazu die Variation von mehr als einem Faktor zu einem Zeitpunkt unter Verwendung der Versuchsplanung (DOE) Strategie (grüne Kreise) erhöht die Reichweite und damit die Genauigkeit der resultierenden Modelle. B. Das vorgespannte Design Raumabdeckung bedeutet, dass OFAT Experimente (schwarze Kreise) kann auch fehlschlagen, um optimale Betriebsbereiche (rot) zu erkennen und vorherzusagen, suboptimale Lösungen (großer schwarzer Kreis), während DoE strategisches (schwarze Sterne) sind eher zu bevorzugten Bedingungen (große schwarze Sterne) zu identifizieren.

Protocol

1. Planen Sie eine DoE-Strategie Identifizieren relevanten Faktoren und Antworten für die Aufnahme in den Entwurf. Definieren Sie eine oder mehrere Antworten für die Messung. Hier wurden 2G12 und DsRed-Expressionsniveaus verwendet (ug / ml), einschließlich der minimalen nachweisbaren Unterschied als relevant (10 und 20 ug / ml) betrachtet und ein Näherungswert für die geschätzte Standardabweichung des Systems (4 und 8 ug / ml) auf der Grundlage früherer Experimente. Verwenden Sie die…

Representative Results

Ein Beschreibungsmodell für DsRed Akkumulation während transiente Expression mit verschiedenen Promotoren und 5'UTRs DsRed-Fluoreszenz in Blattextrakten wurde verwendet, um das Expressionsniveau des rekombinanten Proteins zu zeigen und damit als Antwort auf das SVM-Strategie verwendet. Die minimale nachweisbare Differenz wir als relevant war 20 ug / ml und die geschätzte Standardabweichung des Systems war 8 ug / ml bezogen auf den anfänglichen Experimenten. Faktoren,…

Discussion

Jedes Experiment erfordert eine sorgfältige Planung, da die Ressourcen sind oft knapp und teuer. Dies gilt insbesondere für DoE Strategien, weil Fehler in der Planungsphase (z. B. Auswahl eines Basismodell, die nicht alle wesentlichen Faktor Wechselwirkungen einschließen) im wesentlichen die Vorhersagekraft der resultierenden Modelle verringern und damit entwerten das gesamte Experiment. Allerdings können diese Fehler leicht durch folgenden grundlegenden Verfahren vermieden werden.

…

Materials

Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody