एक केस स्टडी के रूप में तंबाकू में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति: प्रयोगों दृष्टिकोण की डिजाइन का उपयोग कर परिसर सिस्टम की विशेषता
Summary
हम पौधों में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और रिपोर्टर प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति पर transgene नियामक तत्वों, पौधों की वृद्धि और विकास के मापदंडों, और ऊष्मायन की स्थिति के प्रभाव का निर्धारण और मॉडल का उपयोग किया जा सकता है कि प्रयोगों दृष्टिकोण का एक डिजाइन का वर्णन.
Abstract
पौधे कम लागत, scalability, और सुरक्षा सहित biopharmaceuticals के उत्पादन के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं. क्षणिक अभिव्यक्ति कम विकास और उत्पादन टाइम्स के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है, लेकिन अभिव्यक्ति के स्तर इस प्रकार अच्छा विनिर्माण अभ्यास के संदर्भ में नियामक संबंधी चिंताओं को जन्म देने के बैचों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं. हम इस तरह के बैचों के बीच अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता पर अभिव्यक्ति के दौरान विनियामक अभिव्यक्ति निर्माण में तत्वों, पौधों की वृद्धि और विकास के मापदंडों, और ऊष्मायन शर्तों, जैसे प्रमुख कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए प्रयोग (डीओई) दृष्टिकोण का एक डिजाइन इस्तेमाल किया. हम एक मॉडल विरोधी एचआईवी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (2G12) और एक फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन (DsRed) व्यक्त पौधों का परीक्षण किया. हम मॉडल की कुछ संपत्तियों के चयन के लिए औचित्य पर चर्चा करने और अपने संभावित सीमाओं की पहचान. सामान्य दृष्टिकोण आसानी से अन्य समस्याओं को हस्तांतरित किया जा सकता है, क्योंकि मॉडल एक के सिद्धांतोंमोटे तौर पर फिर से लागू हो: छोटे मॉड्यूल, इष्टतम प्रयोग संयोजन के सॉफ्टवेयर निर्देशित सेटअप और कदम के लिहाज से डिजाइन वृद्धि में प्रारंभिक समस्या बंटवारे से ज्ञान आधारित पैरामीटर चयन, जटिलता में कमी. इसलिए, कार्यप्रणाली न केवल पौधों में प्रोटीन अभिव्यक्ति निस्र्पक के लिए, लेकिन यह भी एक यंत्रवत विवरण कमी अन्य जटिल प्रणालियों की जांच के लिए उपयोगी है. मापदंडों के बीच इंटरकनेक्टिविटी का वर्णन भविष्य कहनेवाला समीकरणों अन्य जटिल प्रणालियों के लिए यंत्रवत मॉडल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
पौधों को विकसित करने के लिए सस्ती कर रहे हैं, क्योंकि पौधों में biopharmaceutical प्रोटीन का उत्पादन फायदेमंद है, मंच अभी और अधिक बढ़ पौधों द्वारा बढ़ाया जा सकता है, और मानव रोगज़नक़ों 1,2 नकल करने में असमर्थ हैं. डीएनए वितरण और एक शुद्ध उत्पाद की डिलीवरी की बात के बीच समय साल से कम से कम 2 महीने 3 के लिए कम है क्योंकि Agrobacterium tumefaciens साथ पत्ते की घुसपैठ पर उदाहरण के लिए आधारित क्षणिक अभिव्यक्ति रणनीतियों अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है. क्षणिक अभिव्यक्ति भी नुकसान के समारोह म्यूटेंट करने के लिए पूरक या प्रोटीन बातचीत 4-6 की जांच करने की क्षमता के लिए जीन परीक्षण करने के लिए कार्यात्मक विश्लेषण, उदाहरण के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, क्षणिक अभिव्यक्ति के स्तर ट्रांसजेनिक पौधों 7-9 में अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में अधिक से अधिक बैच को बैच भिन्नता दिखाने के लिए करते हैं. इस biopharmaceutical विनिर्माण प्रक्रियाओं क्षणिक अभिव्यक्ति वाई के आधार पर संभावना है कि कम कर देता हैreproducibility के एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषता है और जोखिम मूल्यांकन 10 के अधीन है क्योंकि अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) के संदर्भ में अनुमोदित किया जाएगा. इस तरह की भिन्नता भी शोधकर्ताओं की जांच करने का इरादा है कि किसी भी बातचीत कर सकते हैं मुखौटा. इसलिए, हम पौधों में क्षणिक अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित और एक उच्च गुणवत्ता वाले मात्रात्मक भविष्य कहनेवाला मॉडल का निर्माण करने के लिए प्रमुख कारक है कि पहचान करने के लिए निकल पड़े.
एक पहलू पर एक समय (OFAT) दृष्टिकोण अक्सर एक प्रयोग 11 के परिणाम पर कुछ मापदंडों (कारक) का प्रभाव (प्रभाव) (प्रतिक्रिया) चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक जांच (प्रयोग) के दौरान व्यक्तिगत परीक्षण (रन) (डिजाइन अंतरिक्ष) का परीक्षण कर रहे हैं कि कारकों से फैला संभावित क्षेत्र के माध्यम से एक तार पर मोती की तरह गठबंधन किया जाएगा बल्कि इसलिए कि इस suboptimal है. अंतरिक्ष डिजाइन और प्रयोग से प्राप्त जानकारी के इसलिए डिग्री की कवरेज हैकम, चित्रा 1 ए 12 में दिखाया गया है. चित्रा 1 बी 13 के रूप में दिखाया इसके अलावा, विभिन्न कारकों (कारक बातचीत) के घटकों के बीच, गरीब मॉडल और / या झूठी ओप्टिमा की भविष्यवाणी में जिसके परिणामस्वरूप छुपा रह सकता है.
ऊपर वर्णित कमियां एक से अधिक कारक दो रन 14 के बीच विभिन्न जिसका अर्थ है कि एक प्रयोग के रन डिजाइन अंतरिक्ष में और अधिक समान रूप से बिखरे हुए हैं जिसमें प्रयोगों (डीओई) दृष्टिकोण का एक डिजाइन का उपयोग करके बचा जा सकता है. कारकों (भाज्य डिजाइन) और प्रतिक्रियाओं पर कारक प्रभावों के quantitation (प्रतिक्रिया सतह तरीकों, RSM ओं) 15 स्क्रीनिंग मिश्रण के लिए विशेष डिजाइन कर रहे हैं. इसके अलावा, RSMs केंद्रीय समग्र डिजाइन के रूप में महसूस किया जा सकता है लेकिन यह भी रन के चयन के लिए विभिन्न मापदंड लागू कर सकते हैं कि विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रभावी ढंग से हासिल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, तथाकथित डी optimalitY कसौटी चतुर्थ optimality कसौटी डिजाइन अंतरिक्ष 15,16 भर में सबसे कम भविष्यवाणी विचरण को प्राप्त है कि रन का चयन करता है, जबकि ऐसा है, जिसके परिणामस्वरूप मॉडल के गुणांक में त्रुटि को कम करने के लिए रन का चयन करेंगे. हम यहाँ वर्णन RSM पौधों में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति की सटीक quantitation की अनुमति देता है, लेकिन यह आसानी से (5-8 ~) कई शामिल किसी भी प्रणाली को हस्तांतरित किया जा सकता है सांख्यिक कारकों (जैसे तापमान, समय, एकाग्रता) और कुछ (~ 2 – 4) एक यंत्रवत विवरण मॉडल पर अनुपलब्ध या बहुत जटिल है categoric कारकों (जैसे प्रमोटर, रंग) जिसमें.
डो दृष्टिकोण कृषि विज्ञान में जन्म लिया है, लेकिन यह यह विश्वसनीय आंकड़े प्राप्त करने के लिए आवश्यक रन की संख्या को कम करने और जटिल प्रक्रियाओं के लिए वर्णनात्मक मॉडल उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है, जहां किसी भी स्थिति के लिए हस्तांतरणीय है क्योंकि अन्य क्षेत्रों में फैल गया है. यह बदले में लिए "मार्गदर्शन डो में शामिल किए जाने के लिए प्रेरित कियाउद्योग, मानव उपयोग के लिए औषधि (आईसीएच) 17 के पंजीकरण के लिए तकनीकी आवश्यकताओं के Harmonisation पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन द्वारा प्रकाशित प्रश्न 8 (R2) औषधि विकास ". डो अब वैज्ञानिक अनुसंधान और उद्योग के 18 में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है. हालांकि, देखभाल के दौरान लिया जाना चाहिए एकाधिक रेखीय प्रतिगमन मॉडल (बेस मॉडल) के लिए एक अनुचित बहुपद डिग्री के चयन क्योंकि योजना और प्रयोग का निष्पादन सही ढंग से सभी कारक प्रभाव मॉडल पर अतिरिक्त रनों के लिए एक की जरूरत को पेश कर सकते हैं. इसके अलावा, भ्रष्ट या लापता डेटा गलत मॉडल और त्रुटिपूर्ण उत्पन्न भविष्यवाणियों, और यहां तक कि प्रोटोकॉल और चर्चा वर्गों 18 में वर्णित के रूप में किसी भी मॉडल के निर्माण के प्रयास को रोक सकता है. प्रोटोकॉल खंड में, हम शुरू में एक RSM आधारित प्रयोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण योजना बना कदम बाहर सेट और उसके बाद डो के आधार पर डिजाइन की व्याख्या करेगा सॉफ्टवेयर DesignExpert v8.1. लेकिन इसी तरह की डिजाइन अन्य सॉफ्टवेयर includi के साथ बनाया जा सकता हैएनजी जेएमपी, Modde, और statistica. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं डेटा विश्लेषण और मूल्यांकन के लिए निर्देश द्वारा पीछा कर रहे हैं.
चित्रा 1. OFAT और डो. एक की तुलना. एक प्रयोग (काले, लाल और नीला हलकों) में एक समय (OFAT) में एक कारक के अनुक्रमिक भिन्नता डिजाइन अंतरिक्ष (रची क्षेत्रों) के एक कम कवरेज प्राप्त होता है. इसके विपरीत, प्रयोगों (डीओई) रणनीति (हरी हलकों) की डिजाइन का उपयोग कर एक समय में एक से अधिक कारक की भिन्नता कवरेज और जिसके परिणामस्वरूप मॉडल. बी के इस प्रकार परिशुद्धता बढ़ाता है. पक्षपाती डिजाइन अंतरिक्ष कवरेज OFAT प्रयोगों (काला हलकों) भी, इष्टतम ऑपरेटिंग क्षेत्रों (लाल) की पहचान और उप इष्टतम समाधान (बड़े काले वृत्त) की भविष्यवाणी करने में असफल हो सकता है कि इसका मतलब है जबकि डो strategiतों (काला सितारों) बेहतर स्थितियां (बड़े ब्लैक स्टार) की पहचान करने की संभावना है.
Protocol
Representative Results
Discussion
संसाधनों की स्थिति खराब है और महंगे हैं क्योंकि हर प्रयोग सावधान योजना की आवश्यकता है. नियोजन चरण (जैसे सभी महत्वपूर्ण कारक बातचीत को कवर नहीं करता है कि एक बेस मॉडल का चयन) के दौरान त्रुटियों को काफ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस अध्ययन में इस्तेमाल तम्बाकू पौधों की खेती के लिए pPAM संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर और इब्राहिम अल Amedi उपलब्ध कराने के लिए डॉ. थॉमस Rademacher के लिए आभारी हैं. हम पांडुलिपि संपादन के साथ उसकी सहायता के लिए डॉ. रिचर्ड एम. Twyman धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में यूरोपीय अनुसंधान परिषद उन्नत अनुदान "भविष्य फार्मा" द्वारा वित्त पोषित किया गया, प्रस्ताव संख्या 269110 और Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer फ्यूचर फाउंडेशन).
Materials
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Tryptone | Carl Roth GmbH | 8952.2 | Media component |
| Yeast extract | Carl Roth GmbH | 2363.2 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH | K029.2 | Antibiotic |
| Agar-Agar | Carl Roth GmbH | 5210.2 | Media component |
| Escherichia coli K12 DH5a | Life technologies | 18263-012 | Microorganism |
| pPAM | GenBank | AY027531 | Cloning/expression vector; |
| NucleoSpin Plasmid | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740588.250 | Plasmid DNA isolation kit |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740609.250 | Plasmid DNA purification kit |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | n.a. | Spectrophotometer |
| NcoI | New England Biolabs Inc. | R3193L | Restrictionendonuclease |
| EcoRI | New England Biolabs Inc. | R3101L | Restrictionendonuclease |
| AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | Restrictionendonuclease |
| NEB 4 | New England Biolabs Inc. | B7004S | Restrictionendonuclease buffer |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Disodium tetraborate | Carl Roth GmbH | 4403.3 | Media component |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8040.2 | Media component |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 6352.4 | Media component |
| Bromophenol blue | Carl Roth GmbH | A512.1 | Color indicator |
| Xylene cyanol | Carl Roth GmbH | A513.1 | Color indicator |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 7530.2 | Media component |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 170-4406 | Gel electrophoresis chamber |
| Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK | DSMZ | 12365 | Microorganism |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | 4307000.658 | Electroporator |
| Beef extract | Carl Roth GmbH | X975.2 | Media component |
| Peptone | Carl Roth GmbH | 2365.2 | Media component |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | Media component |
| Magnesium sulfate | Carl Roth GmbH | 0261.3 | Media component |
| Carbenicillin | Carl Roth GmbH | 6344.2 | Antibiotic |
| Kanamycin | Carl Roth GmbH | T832.3 | Antibiotic |
| Rifampicin | Carl Roth GmbH | 4163.2 | Antibiotic |
| FWD primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCT CAG GAA GAG CAA TAC |
| REV primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCA AAG CGA GTA CAC AAC |
| 2720 Thermal cycler | Applied Biosystems | 4359659 | Thermocycler |
| RNAfold webserver | University of Vienna | n.a. | Software |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | n.a. | Rockwool block |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Omnifix-F Solo | B. Braun | 6064204 | Syringe |
| Murashige and Skoog salts | Duchefa | M 0222.0010 | Media component |
| Glucose | Carl Roth GmbH | 6780.2 | Media component |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Phytohormon analogon |
| BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132 000.008 | Photometer |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| Biacore T200 | GE Healthcare | n.a. | SPR device |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
References
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