Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Summary

Descriviamo un disegno di esperimenti approccio che può essere utilizzato per determinare e modellare l'influenza del transgene elementi regolatori, parametri di crescita e sviluppo delle piante, e condizioni di incubazione sulla espressione transiente di anticorpi monoclonali e proteine ​​reporter nelle piante.

Abstract

Le piante offrono molteplici vantaggi per la produzione di biofarmaci tra cui bassi costi, scalabilità e sicurezza. Espressione transiente offre il vantaggio supplementare di brevi tempi di sviluppo e di produzione, ma i livelli di espressione può variare notevolmente tra i lotti dando così luogo a preoccupazioni di regolamentazione nel contesto delle buone prassi di fabbricazione. Abbiamo usato un disegno degli esperimenti (DoE) approccio per determinare l'impatto dei principali fattori, quali elementi di regolamentazione del costrutto di espressione, la crescita delle piante e parametri di sviluppo, e le condizioni di incubazione durante espressione, sulla variabilità di espressione tra i lotti. Abbiamo testato piante che esprimono un modello anti-HIV anticorpo monoclonale (2G12) e una proteina marcatore fluorescente (DsRed). Discutiamo il razionale per la selezione di alcune proprietà del modello e identificare i suoi potenziali limiti. L'approccio generale può essere facilmente trasferito ad altri problemi perché i principi del modello unre ampiamente applicabile: la selezione dei parametri basata sulla conoscenza, la riduzione della complessità suddividendo il problema iniziale in moduli più piccoli, l'installazione guidata dal software di combinazioni ottimali di esperimento e graduale aumento del design. Pertanto, il metodo non è solo utile per caratterizzare l'espressione della proteina nelle piante, ma anche per la ricerca di altri sistemi complessi privi descrizione meccanicistica. Le equazioni predittive che descrivono l'interconnettività tra i parametri possono essere utilizzati per stabilire modelli meccanicistici per altri sistemi complessi.

Introduction

La produzione di proteine ​​biofarmaceutiche nelle piante è vantaggiosa perché le piante sono economici a crescere, la piattaforma può essere scalata solo crescendo più piante e patogeni umani sono in grado di replicare ^1,2. Strategie espressione transiente basate per esempio sulla infiltrazione di foglie con Agrobacterium tumefaciens offre ulteriori vantaggi perché il tempo tra il punto di consegna del DNA e la consegna di un prodotto purificato è ridotto da anni a meno di 2 mesi ^3. Espressione transiente è utilizzato anche per l'analisi funzionale, ad esempio per testare geni per la loro capacità di complementare perdita di funzione mutanti o per indagare le interazioni proteina ^4-6. Tuttavia, i livelli di espressione transiente tendono a mostrare una maggiore variazione da lotto a lotto di livelli di espressione in piante transgeniche ^7-9. Ciò riduce la probabilità che i processi di produzione biofarmaceutica basati su espressione transiente will essere approvato nel contesto delle buone prassi di fabbricazione (GMP), perché la riproducibilità è un attributo di qualità critico ed è soggetta a valutazione del rischio ^10. Tale variazione può anche mascherare tutte le interazioni che i ricercatori intendono studiare. Pertanto, abbiamo deciso di identificare i principali fattori che influenzano i livelli di espressione transitori nelle piante e per costruire un modello predittivo quantitativo di alta qualità.

L'approccio a un fattore-at-a-tempo (OFAT) è spesso usato per caratterizzare l'impatto (effetto) di alcuni parametri (fattori) sull'esito (risposta) di un esperimento ^11. Ma questo è ottimale perché le prove individuali (va) durante l'indagine (esperimento) saranno allineati come perle di una collana attraverso l'area potenziale attraversato dai fattori che vengono testati (spazio di progettazione). La copertura dello spazio di progettazione e quindi il grado di informazioni derivate da dell'esperimento èbasso, come mostrato nella Figura 1A ^12. Inoltre, interdipendenze tra diversi fattori (interazioni factor) possono rimanere nascosti conseguente modelli poveri e / o la previsione di falsa Optima, come mostrato nella Figura 1B ^13.

Gli inconvenienti sopra descritti possono essere evitati utilizzando un disegno di avvicinamento esperimenti (DOE) in cui viene eseguito su un esperimento sono sparsi in modo più uniforme in tutto lo spazio di progettazione, il che significa che più di un fattore è variata tra due piste ^14. Ci sono disegni specializzati per le miscele, screening fattori (disegni fattoriali) e la quantificazione degli impatti dei fattori sulle risposte (metodi di superficie di risposta, RSM s) ^15. Inoltre, RSMS possono essere realizzati come disegni centrali-composito ma possono anche essere realizzati efficacemente con software specializzato che può applicare diversi criteri per la selezione di piste. Ad esempio, il cosiddetto D-optimality criterio selezionerà corre in modo da minimizzare l'errore nei coefficienti del modello risultante, mentre il criterio IV-ottimalità seleziona piste che raggiungono la varianza previsione basso tutto lo spazio di progettazione ^15,16. La RSM descriviamo qui permette la quantificazione precisa espressione transiente della proteina nelle piante, ma può essere facilmente trasferito su qualsiasi sistema che coinvolge vari (~ 5-8) fattori numerici (ad esempio temperatura, tempo, concentrazione) e alcuni (~ 2 – 4) fattori categorici (es. promoter, colore) in cui una descrizione meccanicistica non è disponibile o troppo complesso per modellare.

L'approccio DoE origine nelle scienze agrarie, ma si è diffuso ad altre zone, perché è trasferibile a qualsiasi situazione in cui è utile per ridurre il numero di corse necessarie per ottenere dati affidabili e generare modelli descrittivi per processi complessi. Questo a sua volta ha portato all'inserimento del DoE nella "Guida perIndustria, Q8 (R2) Pharmaceutical Development ", pubblicato dalla Conferenza internazionale sull'armonizzazione dei requisiti tecnici per la registrazione dei prodotti farmaceutici per uso umano (ICH) ^17. DoE è ormai ampiamente utilizzato nella ricerca scientifica e l'industria ^18. Tuttavia, la cura deve essere presa durante la pianificazione e l'esecuzione dell'esperimento, perché la scelta di un grado del polinomio improprio per il modello multi-lineare di regressione (modello base) possono introdurre la necessità di corse aggiuntive per modellare correttamente tutti gli effetti dei fattori. Inoltre, danneggiati o dati mancanti generano modelli errati e viziata previsioni, e può anche impedire qualsiasi tentativo di costruzione del modello, come descritto nel protocollo e discussione sezioni ^18. Nella sezione Protocollo, ci sarà inizialmente stabilito le fasi di pianificazione più importanti per un esperimento a base di RSM e poi spiegare il progetto sulla base del DoE software DesignExpert v8.1., ma disegni simili possono essere costruiti con altri includi softwareng JMP, Modde, e STATISTICA. Le procedure sperimentali sono seguite da istruzioni per l'analisi e la valutazione dei dati.

Figura 1. Confronto di OFAT e DoE. A. Variazione sequenziale di un fattore alla volta (OFAT) in un esperimento (nero, rosso e blu cerchi) raggiunge una bassa copertura dello spazio di progettazione (regioni tratteggiate). Al contrario, la variazione di più di un fattore alla volta utilizzando la progettazione di esperimenti (DoE) strategia (cerchi verdi) migliora la copertura e quindi la precisione dei modelli risultanti. B. La copertura dello spazio di progettazione di parte significa che gli esperimenti OFAT (cerchi neri) può anche non riuscire a identificare le regioni operative ottimali (rosso) e prevedere soluzioni sub-ottimali (grande cerchio nero), mentre DoE strategies (stelle nere) sono più propensi a identificare le condizioni preferibili (grande black star).

Protocol

1. Pianificazione di una strategia DoE Identificare i fattori e le risposte pertinenti per l'inclusione nel progetto. Definire una o più risposte per la misura. Qui, sono stati usati i livelli di espressione 2G12 e DsRed (mcg / ml), compresa la differenza minima rilevabile considerate pertinenti (10 e 20 mg / ml, rispettivamente) e un valore approssimativo per la deviazione standard stimata del sistema (4 e 8 mg / ml, rispettivamente) sulla base di esperimenti precedenti. Utilizzare la…

Representative Results

Un modello descrittivo per l'accumulo DsRed durante espressione transiente utilizzando diversi promotori e 5'UTRs Fluorescenza DsRED in estratti di foglie è stato usato per indicare il livello di espressione della proteina ricombinante e quindi è stato usato come la risposta nella strategia DoE. La differenza minima rilevabile abbiamo considerato rilevante era di 20 mcg / ml e la deviazione standard stimata del sistema era di 8 mg / ml in base a esperimenti inizial…

Discussion

Ogni esperimento richiede un'attenta pianificazione, perché le risorse sono spesso scarse e costose. Ciò è particolarmente vero per le strategie DoE perché errori durante la fase di pianificazione (ad esempio la selezione di un modello di base che non copre tutte le interazioni significative dei fattori) possono diminuire sostanzialmente il potere predittivo dei modelli risultanti e quindi svalutare l'intero esperimento. Tuttavia, questi errori possono essere facilmente evitati seguendo procedure di…

Materials

Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody