Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

Summary

Se describe un diseño de enfoque experimentos que se puede utilizar para determinar y modelar la influencia de los elementos reguladores de transgenes, los parámetros de crecimiento y desarrollo de la planta, y las condiciones de incubación en la expresión transitoria de los anticuerpos monoclonales y proteínas reportero en plantas.

Abstract

Las plantas proporcionan múltiples beneficios para la producción de productos biofarmacéuticos incluyendo bajos costos, escalabilidad y seguridad. La expresión transitoria ofrece la ventaja adicional de desarrollo a corto y tiempos de producción, pero los niveles de expresión puede variar significativamente entre los lotes, dando así lugar a preocupaciones de reglamentación en el contexto de las buenas prácticas de fabricación. Se utilizó un diseño de enfoque experimentos (DoE) para determinar el impacto de los factores más importantes, como elementos reguladores en la construcción de expresión, crecimiento de las plantas y de los parámetros de desarrollo y las condiciones de incubación durante la expresión, en la variabilidad de la expresión entre lotes. Hemos probado plantas que expresan un anticuerpo monoclonal anti-VIH modelo (2G12) y una proteína marcadora fluorescente (DsRed). Se discute la justificación de la selección de ciertas propiedades del modelo e identificar sus posibles limitaciones. El enfoque general puede ser fácilmente transferido a otros problemas debido a que los principios del modelo de unre ampliamente aplicable: selección de parámetros basada en el conocimiento, la reducción de la complejidad mediante la división del problema inicial en módulos más pequeños, la instalación del software guiado de las combinaciones óptimas de experimentos y el aumento de diseño por etapas. Por lo tanto, la metodología no sólo es útil para la caracterización de la expresión de proteínas en las plantas, sino también para la investigación de otros sistemas complejos que carecen de una descripción mecanicista. Las ecuaciones de predicción que describen la interconectividad entre los parámetros pueden ser utilizados para establecer modelos mecánicos para otros sistemas complejos.

Introduction

La producción de proteínas biofarmacéuticas en las plantas es ventajoso porque las plantas son de bajo costo para crecer, la plataforma puede ser ampliado con sólo crece más plantas, y los patógenos humanos son incapaces de replicarse ^1,2. Las estrategias de expresión transitoria basados ​​por ejemplo en la infiltración de las hojas con Agrobacterium tumefaciens proporciona beneficios adicionales ya que el tiempo entre el punto de entrega de ADN y la entrega de un producto purificado se reduce de año a menos de 2 meses ^3. La expresión transitoria también se utiliza para el análisis funcional, por ejemplo, para probar los genes por su capacidad para complementar mutantes de pérdida de función o para investigar las interacciones de proteínas ^4-6. Sin embargo, los niveles de expresión transitoria tienden a mostrar una mayor variación de lote a lote de los niveles de expresión en plantas transgénicas ^7-9. Esto reduce la probabilidad de que los procesos de fabricación biofarmacéutica basan en wi expresión transitoriall ser aprobado en el marco de las buenas prácticas de fabricación (GMP), ya que la reproducibilidad es un atributo crítico calidad y está sujeta a la evaluación de riesgos ^10. Esta variación también puede enmascarar cualquier interacción que los investigadores tienen la intención de investigar. Por lo tanto, nos propusimos identificar los principales factores que afectan los niveles de expresión transitoria en plantas y construir un modelo de predicción cuantitativa de alta calidad.

El enfoque de un factor-en-un-tiempo (OFAT) se utiliza a menudo para caracterizar el impacto (efecto) de ciertos parámetros (factores) sobre el resultado (respuesta) de un experimento ^11. Pero esto no es óptima debido a que las pruebas individuales (corre) durante una investigación (experimento) estarán alineados como perlas en una cuerda a través del área potencial abarcado por los factores que se evalúan (espacio de diseño). La cobertura del espacio de diseño y por lo tanto el grado de información derivada de la experimento esbajo, como se muestra en la Figura 1A ^12. Además, las interdependencias entre los diferentes factores (interacciones de factores) pueden permanecer ocultos que resulta en modelos pobres y / o la predicción de falsa Optima, como se muestra en la Figura 1B ^13.

Los inconvenientes descritos anteriormente se pueden evitar mediante el uso de un diseño de experimentos de aproximación (DoE) en la que se ejecuta de un experimento se dispersan de manera más uniforme en todo el espacio de diseño, lo que significa que más de un factor se varía entre dos carreras ^14. Hay diseños especializados para las mezclas, los factores (diseños factoriales) y la cuantificación de los impactos de los factores sobre las respuestas (métodos de superficie de respuesta, RSM s) ¹⁵ de detección. Además, RSM se pueden realizar como diseños-compuesto central, pero también se puede lograr de manera efectiva mediante el uso de software especializado que puede aplicar diferentes criterios para la selección de carreras. Por ejemplo, el llamado D-optimalitcriterio y seleccionará carreras a fin de minimizar el error en los coeficientes del modelo resultante, mientras que el criterio IV-optimalidad selecciona carreras que logran la varianza de predicción más bajo en todo el espacio de diseño ^15,16. El RSM como se describe aquí permite la cuantificación precisa de la expresión de proteína transitoria en plantas, pero que puede ser fácilmente transferido a cualquier sistema que implica varios (~ 5-8) factores numéricos (por ejemplo, temperatura, tiempo, concentración) y unos pocos (~ 2 – 4) factores categóricas (por ejemplo, promotor, color) en el que una descripción mecanicista no está disponible o demasiado complejo para modelar.

El enfoque DoE se originó en las ciencias agrícolas, pero se ha extendido a otras áreas, ya que es transferible a cualquier situación en la que es útil para reducir el número de ciclos necesarios para obtener datos fiables y generar modelos descriptivos de procesos complejos. Esto a su vez ha dado lugar a la inclusión del DoE en la "Guía para laIndustria, Q8 (R2) Desarrollo Farmacéutico ", publicado por la Conferencia Internacional sobre Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Uso Humano (ICH) ^17. DoE ahora se utiliza ampliamente en la investigación científica y la industria ^18. Sin embargo, se debe tener cuidado durante la planificación y ejecución del experimento, porque la selección de un grado del polinomio impropio para el modelo de regresión lineal múltiple (modelo base) pueden presentar una necesidad de tiradas adicionales para modelar los efectos de los factores correctamente. Además, dañados o datos faltantes generan modelos incorrectos y defectuoso predicciones, y puede incluso prevenir cualquier intento de construcción de modelos, como se describe en el protocolo y de discusión de los artículos ^18. En la sección de protocolo, que inicialmente se establecerán los pasos de planificación más importantes para un experimento basado en la RSM y luego explicar el diseño basado en el DoE software v8.1 DesignExpert. Pero diseños similares se pueden construir con otros includi softwareng JMP, Modde y STATISTICA. Los procedimientos experimentales son seguidos por instrucciones para el análisis y evaluación de datos.

Figura 1. Comparativa de. OFAT y DoE A. Variación secuencial de un factor a la vez (OFAT) en un experimento (círculos negros, rojos y azules) logra una baja cobertura del diseño de espacio (regiones sombreadas). Por el contrario, la variación de más de un factor a la vez usando el diseño de experimentos de estrategia (DoE) (círculos verdes) mejora la cobertura y por lo tanto la precisión de los modelos resultantes. B. La cobertura de espacio de diseño sesgada significa que los experimentos OFAT (círculos negros) también pueden fallar para identificar regiones óptimas de operación (rojo) y predecir soluciones sub-óptimas (gran círculo negro), mientras que el DoE strategies (estrellas negras) son más propensos a identificar condiciones preferentes (gran estrella negro).

Protocol

1. Planificación de una estrategia DoE Identificar los factores y las respuestas pertinentes para su inclusión en el diseño. Definir una o varias respuestas para la medición. Aquí, se utilizaron niveles de expresión 2G12 y DsRed (g / ml), incluyendo la diferencia mínima detectable considerado como relevantes (10 y 20 mg / ml, respectivamente) y un valor aproximado para la desviación estándar estimada del sistema (4 y 8 mg / ml, respectivamente) sobre la base de los experimentos anteriores. <…

Representative Results

Un modelo descriptivo para la acumulación de DsRed durante la expresión transitoria utilizando diferentes promotores y 5'UTRs DsRed de fluorescencia en los extractos de hoja se utiliza para indicar el nivel de expresión de la proteína recombinante y de este modo se utilizó como la respuesta en la estrategia DoE. La diferencia mínima detectable consideramos relevante fue de 20 mg / ml y la desviación estándar estimada del sistema fue de 8 mg / ml en base a los exp…

Discussion

Cada experimento requiere una planificación cuidadosa, porque los recursos suelen ser escasos y caros. Esto es particularmente cierto para las estrategias del Departamento de energía debido a errores durante la fase de planificación (por ejemplo, la selección de un modelo base que no cubra todas las interacciones significativas factores) pueden disminuir sustancialmente la capacidad predictiva de los modelos resultantes y así devaluar todo el experimento. Sin embargo, estos errores se pueden evitar fácilm…

Materials

Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody