이 프로토콜은 단일 세포 현탁액 분해없이 구형 신경 줄기 및 전구 세포 응집체의 확장을 허용 신규 기계적 자르고 방법을 설명한다. 세포 / 세포의 접촉을 유지하는 것은 40 구절에 대한 신속하고 안정적인 성장을 할 수 있습니다.
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방법 논문
인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
실험 연구와 임상 시험을위한 단일 시료로부터 세포의 큰 숫자를 축적하는 셀 확장 기술은 크게 줄기 세포 사회를 유익 것이다. 현재의 많은 확장 방법은 힘들고 비용이 많이 드는, 완전한 분리를 포함하는 여러 줄기 및 전구 세포 유형의 분화 또는 초기 노화를 받아야하는 원인이 될 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 간단하고 저렴하다 "마"라 자동화 기계류 계대 방법을 개발했다. 이 기술은 단일 세포로 화학 물질 또는 효소 분해를 방지하고 대신 상수 세포 / 세포 접촉을 유지 정지, 회전 타원체 문화의 대규모 확장 할 수 있습니다. 초핑 방법은 주로 태아 뇌 유래 신경 전구 세포 또는 neurosphere를 위해 사용되었으며, 최근 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래의 신경 줄기 세포를 사용하기 위해 발행되었다. 프로 시저 involv에스 조직 문화 배양 접시에 neurosphere를 파종 이후에 효과적으로 수동으로 기계적으로 각 영역을 해리의 지루한 과정을 자동화 세포를 통해 날카로운, 멸균 블레이드를 전달합니다. 문화의 세포를 일시 중단하면 유리한 표면적 - 부피 비율을 제공한다; 500,000 이상의 세포는 직경이 0.5 mm 미만의 단일 neurosphere 내 성장시킬 수있는. 한 T175 플라스크에서 50 백만 셀은 1500 만 자기편 문화에 비해 서스펜션 문화에서 성장할 수 있습니다. 중요한 것은, 마 절차는 임상 수준의 세포 제품의 대량 수량의 생산을 허용, 현재 좋은 제조 연습 (cGMP의)에서 사용되어왔다.
서론
단층 1-3 또는 집계 neurosphere를 4-7 중 하나로 문화에 쥐 신경 줄기 세포 확장의 긴 역사가있다. 또, 현상 중추 신경계 8-17의 다양한 영역들로부터 격리 된 인간 신경 전구 세포 (hNPCs)는 시험 관내에서 확장되었다. 이 세포는 이중 강력한, 성상 세포 및 신경 세포 모두로 분화 할 수 있으며 신경 발달 (18, 19)과 질병 메커니즘 (20, 21)를 연구에 매우 유용한 도구가되고있다. hNPCs도 통합, 생존 및 기능 효과 22-24 다양한 수준의 중추 신경계 질환의 다양한 동물 모델에 이식되었다.
종종 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 또는 섬유 아세포 성장 인자 -2 (FGF-2) 25 ~ 28 - - 및 접착 29 세 모두 전통적 설치류 또는 인간 태아 유래의 NPC가 성장 인자에 노출되어차원 타원체 시스템은 일반적으로 단일 세포 현탁액 30-34로 효소 적 분해를 사용하여 계대된다. 연구 또는 임상 사용을위한 세포를 확장하는 표준 방법은 쉬운 조작에 의한 부착 단층과 같다. 그러나, 우리는 효소 또는 화학 솔루션 계....
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프로토콜
1. 윤리 정책 및 안전
- 이 절차는 인간 또는 동물 유래의 세포 배양 제품의 사용을 포함한다. 모든 파생 된 조직은 해당 기관 검토위원회 (들) 및 / 또는 기관 동물 케어 및 사용위원회 (들)에 의해 사용하기 전에 승인을 받아야합니다.
- 모든 생물의 유해 폐기물은 각각의 기관에서 결정한 안전 규정에 따라 처리해야합니다. 알이 절차를 통해 apposite 안전 및 폐기의 모든 지침을 따르십시오.
장비 2. 준비, 소모품, 시약 및 관찰
- 준비하기
- 유리 페트리 접시, 8.5 cm의 여과지 원과 더블 에지 준비 블레이드를 얻습니다.
- 페트리 접시에 필터 종이를 놓고 페트리 접시에서 필터 용지에 여러 뽑았으니 블레이드를 전송합니다.
- 페트리 접시까지 반복 층 필터 종이와 블레이드가 약 75 % 할인, 가득, 커버 재치시간 페트리 접시의 뚜껑과 오토 클레이브. 불임을 유지하기 위해 멸균 또는 밀폐 된 환경에서 보관하십시오.
- 압력솥 18cm 집게 및 살균 주머니에서 고압 멸균 너트 드라이버. 의 cGMP 생산을 위해, 살균 주머니에 여러 스테인리스 심 디스크를 압력솥. 심 디스크에 대한 자세한 내용은 단계 5를 참조하십....
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결과
P19 냉동 hNPCs의 그림 5. 대표 데이터.) 예상 세포 수는 다음 해동 마 방법을 통해 계대 neurosphere를 비교하여 효소 분해를 사용하여 부착 단일 층으로 확장. 세포가 P20에 해동했을 때 일 0 나타냅니다. B) 분야의 대표 이미지를 미리 잘라, 구 후 절단, 10X. D) 색상 견본이 미디어 조절의 정도를 설명하는 데 사용의 cGMP-의 10 배. C) 대표 이미지 유사한 프로토콜. E) 1 일 동안 도금 및 네 스틴 (적색) 표현 염색 해동 P29의 hNPCs의 면역 세포 화학. 칠일 기미를 위.......
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토론
그림 6. 마 회로도. 기계적 마 방법을 사용하여 문화 구형 줄기 / 전구 세포를 확장.
중요한 단계
마 팽창 패러다임의 개요. hNPC 구면 사이즈을 neurospheres 계대 전에 관찰하는 중요한 기준 중 하나가도 6에 도시된다. 구체의 크기에서 큰 차이가 있지만, 구체의 적어도 30 %는 직경이보다 큰 300 μM을 가져야한다. 구체 통로에 너무 작은 경우에, 단순히 신선한 MM (25 % -50 %)과 CM을 교환하고 재평가 1-4일 후에. 구체는 직경이 너무 작은에서 계대 때별로 확장 요금이 발.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리는 중요한 검토 및 본 보고서의 편집을 위해 박사 Soshana Svendsen은 감사합니다. 이 작품은 NIH / NINDS 1U24NS078370-01 및 CIRM DR2A-05320에 의해 기여했다.
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재료
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| 비커, 50 ml | Fisherbrand | FB-100-50 | 여러 제조업체/공급업체 |
| Bio-Safety Cabinet, class II | Baker | SG-603A | 4 ft. 또는 6 ft. 모델. 6 ft. 모델 권장; 여러 제조업체/공급업체 |
| Blades, Double-edge Prep | Personna | 74-0002 | 여러 제조업체/공급업체. 주의: 샤프 |
| 셀 냉동 매체 | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | DMSO, 무혈청 |
| 원심분리기, 15ml 인서트가 있는 스윙 버킷 | Eppendorf | 5810 R | 여러 제조업체/공급업체 |
| Conical Tubes, 15ml | Fisherbrand | S50712 | 여러 제조업체/공급업체 |
| Conical Tubes, 50 ml | BD Falcon | 352074 | 여러 제조업체/ 공급 업체 |
| Controlled Rate Freezer | Planer | Kryo 750 | 여러 제조 업체/공급 업체 |
| Cryovials, 2 ml | Corning | 430488 | 여러 제조 업체/공급 업체 |
| Culture Flask, Vented, T12.5 | BD Falcon | 353107 | 여러 제조 업체/공급 업체 |
| Culture Flask, Vented, T25 | BD Falcon | 353081 | 여러 제조 업체/공급 업체 |
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| 필터, 0.22 &마이크로; m, 첨부된 컵, 150 ml | Millipore | SCGVU01RE | 여러 제조업체/공급업체 |
| 필터, 0.22 &마이크로; m, 첨부된 컵, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | 여러 제조업체/공급업체 |
| 필터, 0.22 &마이크로; m, 첨부된 컵, 50 ml | Millipore | SCGP00525 | 여러 제조업체/공급업체 |
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| TrypLE Select (1x) | Life Technologies | 12563-011 |
참고문헌
- Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cel....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.
A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley
to:
Clive Svendsen
