النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين
Summary
من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.
Abstract
الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية مصنوعة من الحمض النووي والبروتينات التي تتحكم في العمليات التي تعتمد على الحمض النووي المختلفة. وينظم هيكل لونين وظيفة في مناطق معينة من التخصيب المحلي للهيستون بعد متعدية التعديلات (hPTMs) والمتغيرات، والبروتينات ملزمة لونين، بما في ذلك عوامل النسخ، والحامض النووي. توصيف البروتين من تكوين لونين في مناطق وظيفية متميزة أعاق حتى الآن بسبب عدم وجود بروتوكولات فعالة لإثراء هذه المجالات في النقاء وكمية مناسبة لاحقة لتحليل متعمق من قبل الطيف الكتلي (MS). نحن هنا وصف استراتيجية البروتينات لونين المصممة حديثا، واسمه ChroP (CHRO ماتان P roteomics)، حيث تم استخدام لونين مناعي التحضيرية لعزل المناطق التي لونين متميزة الميزات، من حيث hPTMs، وشارك المتغيرات المرتبطة البروتينات غير histonic، هي تحليلها من قبل MS. نحن لتوضيح انهإعادة المنطقة لاقامة ChroP لإثراء وتحليل المناطق heterochromatic الصمت transcriptionally، والتي تمثلت في وجود ثلاثي مثيلة ليسين 9 على هيستون H3. النتائج التي تحققت بيان إمكانيات ChroP في وصف بدقة بروتيوم المغاير واثبات ذلك باعتبارها استراتيجية تحليلية قوية لفهم كيفية محددات البروتين متميزة من لونين تفاعل وتضافر لإنشاء تكوينات الهيكلية والوظيفية مكان محدد.
Introduction
الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية التي تشارك كقالب الأساسي لكافة العمليات بوساطة الحمض النووي. النيوكليوسومات هي الوحدة الأساسية المتكررة من لونين وتتكون من نواة octameric البروتينية التي تحتوي على جزيئين من كل H2A هيستون الكنسي، H2B، H3 H4 و، وتجمع حولها 147 سنة مضت من الحمض النووي يتم تغليف 1،2. وتنظم كل histones الأساسية كمجال كروي ومرنة N-محطة "ذيل" أن يبرز خارج جسيم نووي. ويستند إحدى الآليات الرئيسية لتنظيم بنية الكروماتين وديناميكية على التساهمية التعديلات بعد متعدية (PTMs)، والتي تحدث أساسا على N-تيرميني من الهستونات 3،4. يمكن التعديلات هيستون تعمل إما عن طريق تغيير بنية النظام أعلى لونين، من خلال تغيير الاتصالات بين الهستونات-DNA أو بين Nucleosomes لل، وبالتالي السيطرة على إمكانية الحصول على البروتينات ملزمة الحمض النووي (آليات رابطة الدول المستقلة)، أو عن طريق العمل كمركز dockinز مواقع للبروتينات التنظيمية، إما وحدة واحدة، أو جزءا لا يتجزأ من المجمعات multimeric. ويمكن لهذه البروتينات التي تنظم ممارسة وظيفتها في طرق مختلفة: عن طريق تحوير مباشرة التعبير الجيني (أي البروتينات TAF)، أو عن طريق تغيير وضع النيوكليوسومات (أي لونين إعادة عرض المجمعات) أو عن طريق تعديل بقايا هيستون الأخرى (أي البروتينات مع ميثيل ترانسفيراز أو أسيتيل النشاط ترانسفيراز) (الآليات العابرة) 5. ملاحظة أن أنماط متميزة PTM العنقودية في مواضع محددة لونين أدى إلى وضع فرضية أن تعديلات مختلفة في مواقع متميزة قد تضافر لتوليد رمز الجزيئية التوسط في حالة وظيفية من الحمض النووي الأساسي. اكتسب "فرضية كود هيستون" توافق كبير في السنوات ولكن تم التحقق التجريبي الذي عقد قبل الظهر القيود التقنية 6،7.
وقد برزت البروتيوميات مطياف الكتلة (MS) على النحو الوارد فيأداة قوية لرسم أنماط تعديل هيستون وتميز ملزم لونين البروتينات 8. MS بالكشف عن التعديل باعتباره Δmass محددة بين كتلة التجريبية والنظرية من الببتيد. على مستوى الهستونات الفردية، MS يوفر وسيلة غير متحيزة وشاملة لخريطة PTMs، والسماح للكشف عن تعديلات جديدة وinterplays كاشفة بينهم 9-14.
في السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الاستراتيجيات لتشريح تكوين البروتين لونين، بما في ذلك توصيف الكروموسومات سليمة الإنقسامية 15، وتحديد للذوبان في ملزمة hPTM البروتينات 16-18 وعزل وتحليل مناطق محددة لونين (أي التيلوميرات) 19،20. ومع ذلك، والتحقيق في أوجه التآزر موضع محددة بين PTMs هيستون، المتغيرات، والبروتينات المرتبطة ونين لا تزال غير مكتملة. هنا، نحن تصف نهجا جديدا، واسمه ChroP (الاستشراب roteomics ماتان P) 21، وأننا قد وضعت لتميز بكفاءة متميزة وظيفيا المجالات لونين. هذا النهج يتكيف مناعي لونين (رقاقة)، وبروتوكول راسخة المستخدمة في البحوث جينية، لتحليل البروتين كفاءة يستند إلى MS-من العينة المخصب. وضعنا اثنين من بروتوكولات مختلفة، اعتمادا على نوع من لونين تستخدم كمدخل ومسألة تتناولها MS؛ على وجه الخصوص: يعمل 1) الشذرة من لونين الأم غير المثبتة يتفاعل مع MNase لتنقية أحادية Nucleosomes للوتشريح hPTMs شارك في ربط (N-ChroP)؛ 2) يستخدم الشذرة من لونين crosslinked مجزأة بواسطة صوتنة في تركيبة مع استراتيجية interactomics القائم على SILAC لتوصيف جميع المشاركين في إثراء البروتينات لونين (X-ChroP) ملزمة. نحن هنا توضيح مزيج من N-X-وChroP لإثراء ودراسة المغاير، وذلك باستخدام H3K9me3 كطعم للخطوات مناعي. استخدام ChroP يمكن تمديدهاإما لدراسة مناطق مختلفة على لونين، أو تغييرات في تركيبة لونين داخل المنطقة نفسها خلال الفترة الانتقالية إلى حالة وظيفية مختلفة، مما يمهد الطريق لتطبيقات مختلفة في علم التخلق.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفناها مؤخرا ChroP، استراتيجية الكمية لتوصيف نطاق واسع من مكونات البروتين لونين. ChroP يجمع بين نهجين متكاملين المستخدمة في مجال جينية، والشذرة MS، والاستفادة من نقاط القوة والتغلب على القيود الخاصة بها. الشذرة جانب لتسلسل عميق (رقاقة تسلسل) يسمح للرسم خرائط الجينوم واس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد نشر هذا البحث في الأصل في مول البروتيوميات الخلية. Soldi M. وBonaldi T. والبروتيومية التحقيق في لونين المجالات الوظيفية يكشف رواية Synergisms بين مكونات متميزة المغاير MCP. عام 2013؛ 12: 64-80. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. نشكر روبرتا Noberini (المعهد الإيطالي للتكنولوجيا ومكتب التقييم المستقل، إيطاليا) لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم عمل السل من المنح المقدمة من جامعة هارفارد، Armenise برنامج جيوفاني مؤسسة التطوير الوظيفي، والجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان ووزارة الصحة الإيطالية. وأيد العمل MS بواسطة زمالة FIRC.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
