L'approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina
Summary
Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.
Abstract
Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico fatto di DNA e proteine che controlla vari processi DNA-dipendente. Struttura della cromatina e la funzione in regioni specifiche è regolato dalla arricchimento locale della istone post-traslazionale modifiche (hPTMs) e varianti, proteine della cromatina vincolanti, compresi fattori di trascrizione, e la metilazione del DNA. La caratterizzazione proteomica di composizione cromatina in corrispondenza di zone funzionali distinti è stata finora ostacolata dalla mancanza di protocolli efficienti per arricchire tali domini alla purezza e quantità appropriata per la successiva analisi approfondita da spettrometria di massa (MS). Descriviamo qui una strategia proteomica cromatina di nuova concezione, denominato ChroP (cromatografia matin P roteomics), per cui un immunoprecipitazione della cromatina preparativa è utilizzato per isolare le regioni della cromatina distinte le cui caratteristiche, in termini di hPTMs, varianti e co-associati proteine non istoniche, sono analizzati da MS. Illustriamo luire la creazione di ChroP per l'arricchimento e l'analisi delle regioni heterochromatic trascrizionalmente silenti, caratterizzato dalla presenza di tri-metilazione della lisina 9 su istone H3. I risultati ottenuti dimostrano il potenziale di ChroP in fondo caratterizzare il proteoma eterocromatina e dimostrare come una strategia analitica potente per comprendere come i determinanti proteici distinti di cromatina interagiscono e sinergizzare stabilire configurazioni strutturali e funzionali specifici locus.
Introduction
Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico che è coinvolto come modello primario per tutti i processi di DNA-mediata. Il nucleosoma è l'unità ripetuta di base della cromatina e costituito da un nucleo octameric proteica contenente due molecole di ciascun istone H2A canonica, H2B, H3 e H4, attorno al quale 147 bp di DNA sono avvolte 1,2. Tutti gli istoni fondamentali sono strutturati come un dominio globulare e flessibile N-terminale "coda" che sporge al di fuori del nucleosoma. Uno dei principali meccanismi di regolazione della struttura della cromatina e la dinamica si basa su covalenti modificazioni post-traduzionali (PTM), che si verificano principalmente sulla N-terminali degli istoni 3,4. Modificazioni degli istoni possono funzionare alterando la struttura superiore ordine cromatina, cambiando contatti tra istoni-DNA o tra nucleosomi, e controllando così l'accessibilità di DNA-binding proteine (meccanismi cis), o agendo come DockInSiti g di proteine regolatrici, sia come unità singole o incorporati in complessi multimerici. Tali proteine regolatrici possono esercitare la loro funzione in modi diversi: modulando direttamente l'espressione genica (pe proteine TAF), o alterando il posizionamento nucleosoma (cioè cromatina rimodellamento complessi) o modificando altri residui istoni (ad esempio proteine con metil-transferasi o acetil- attività transferasi) (meccanismi trans) 5. L'osservazione che distinto PTM modelli cluster alla specifica loci cromatina portato all'elaborazione della ipotesi che diverse modifiche al sito di distinte possono sinergizzare per generare un codice molecolare mediare lo stato funzionale del DNA sottostante. Il "codice dell'istone ipotesi" ha ottenuto grandi consensi negli anni, ma la sua verifica sperimentale è stata frenata da limiti tecnici 6,7.
Proteomica basati su spettrometria di massa (MS) è emerso come unpotente strumento per mappare i modelli modificazione degli istoni e caratterizzare-cromatina proteine che legano 8. MS rileva un cambiamento come Δmass specifico tra la massa sperimentale e teorica di un peptide. A livello di singoli istoni, MS fornisce un metodo imparziale e completa per mappare PTM, consentendo l'individuazione di nuove modifiche e il loro concatenamento rivelando tra loro 9-14.
Negli ultimi anni, una serie di strategie sono state sviluppate per sezionare la composizione proteomica di cromatina, compresa la caratterizzazione della intatte cromosomi mitotici 15, l'identificazione di solubili Hptm-binding proteins 16-18 e l'isolamento e l'analisi di specifiche regioni della cromatina (ossia telomeri) 19,20. Tuttavia, l'indagine delle sinergie specifico locus tra PTM degli istoni, le varianti, e proteine della cromatina associate è ancora incompleto. Qui, descriviamo un nuovo approccio, denominato ChroP (CHRO matin P roteomics) 21, che abbiamo sviluppato per caratterizzare in modo efficiente i domini di cromatina funzionalmente distinte. Questo approccio si adatta immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), un protocollo ben consolidata utilizzati nella ricerca epigenetica, per l'efficace analisi proteomica basata su MS del campione arricchito. Abbiamo sviluppato due protocolli diversi, a seconda del tipo di cromatina utilizzato come ingresso e la domanda indirizzata da MS; in particolare: 1) circuito integrato di unfixed cromatina nativa digerito con MNase è impiegato per purificare mono-nucleosomi ed a sezionare le hPTMs co-associano (N-ChroP); 2) circuito integrato di cromatina reticolato frammentata mediante sonicazione è usato in combinazione con una strategia basata intergenomica SILAC-caratterizzare tutti co-arricchimento proteine (X-ChroP) vincolante cromatina. Illustriamo qui la combinazione di N-e X-ChroP per l'arricchimento e lo studio eterocromatina, utilizzando H3K9me3 come esca per i passi immunoprecipitazione. L'uso di ChroP può essere estesostudiare sia le regioni distinte su cromatina, o cambiamenti nella composizione della cromatina all'interno della stessa regione durante la transizione a uno stato funzionale diversa, aprendo così la strada a varie applicazioni in epigenetica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo recentemente descritto ChroP, una strategia quantitativa per la caratterizzazione su larga scala dei componenti proteici della cromatina. ChroP combina due approcci complementari utilizzati in campo epigenetico, Chip e MS, approfittando loro punti di forza e superando i rispettivi limiti. ChIP accoppiato al sequenziamento profondo (ChIP-Seq) consente la mappatura genoma di modificazioni degli istoni alla risoluzione di alcune nucleosomi 35. Pur vantaggiosa per la loro sensibilità, saggi basati su ant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Mol Proteomica cellulari. Soldi M. Bonaldi T. La Proteomica Indagine della cromatina domini funzionali rivela Nuove sinergie tra distinte Eterocromatina Componenti MCP. 2013; 12: 64-80. © Società Americana per la Biochimica e Biologia Molecolare. Ringraziamo Roberta Noberini (Istituto Italiano di Tecnologia e IEO, Italia) per la lettura critica del manoscritto. Lavoro TB è sostenuto da finanziamenti della Fondazione Armenise-Harvard Career Development Program Giovanni, l'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro e il Ministero della Salute italiano. Lavoro MS è stato sostenuto da una borsa di studio FIRC.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
