ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합
Summary
기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.
Abstract
염색질은 다양한 DNA에 의존하는 프로세스를 제어하는 DNA와 단백질로 이루어진 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 특정 지역에서 염색질의 구조와 기능은 전사 인자 및 DNA 메틸화를 포함 히스톤 번역 후 변형 (hPTMs) 및 변종, 크로 마틴 결합 단백질의 지역 농축에 의해 조절된다. 서로 다른 기능 영역에서 크로 마틴 조성물의 프로테오믹스 특성은 지금까지 질량 분석 (MS)에 의해 후속 심층 분석에 적합한 순도와 양에 같은 도메인을 풍부하게하는 효율적인 프로토콜의 부족에 의해 방해되었다. 우리는 여기에 예비 크로 마틴 면역이 그 기능 hPTMs의 측면에서, 변종 공동 관련된 비 histonic 단백질 별개의 염색질 영역을 분리하는 데 사용된다 ChroP (색도 MATIN의 P의 roteomics)라는 이름의 새롭게 디자인 된 염색질 단백질 체학 전략을, 설명 MS에 의해 분석 하였다. 우리는 그가를 설명히스톤 H3상의 라이신 9의 트라이 메틸화의 존재에 의해 표시 전사적으로 침묵 염색질 영역의 농축 및 분석을위한 ChroP의 설정까지 재. 달성 된 결과는 완전히 이질 염색질 프로테옴의 특징과 염색질의 고유 한 단백질 결정의 상호 작용 및 현장 별 구조 및 기능 구성을 설정하는 시너지 효과 방법을 이해하기위한 강력한 분석 전략으로 그것을 증명에 ChroP의 가능성을 보여줍니다.
Introduction
염색질은 모든 DNA가 중재 프로세스에 대한 기본 템플릿으로 관여하는 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 뉴 클레오 솜은 염색질의 기본 반복 단위이며, DNA의 147 BP는 1, 2를 포장하는 주위에 각 표준 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4, 두 분자를 포함하는 단백질 octameric 코어로 구성되어 있습니다. 모든 핵심 히스톤은 구형 도메인과 뉴 클레오 외부에 돌출 유연한 N-말단 "꼬리"로 구성되어있다. 염색질 구조와 역학을 조절하기위한 중요한 메커니즘 중 하나는 주로 3,4 히스톤의 N-말단에 공유 결합이 발생 번역 후 변형 (PTMS)에 기초한다. 히스톤 변형이 히스톤-DNA 사이 또는 뉴 클레오 간의 접점을 변경함으로써, 고차 염색질 구조를 변경하고, 따라서 DNA 결합 단백질 (시스 메카니즘)의 액세스 가능성을 제어함으로써 어느 작동하거나 dockin 역할을하여규제 단백질, 하나 하나의 단위 또는 다중 체 복합체에 포함 된 같은 G 사이트. 이러한 조절 단백질이 다른 방법으로 그 기능을 발휘할 수있다 : 직접 유전자 발현 (즉, TAF 단백질)을 변조하여, 또는 뉴 클레오 솜 위치 (즉, 염색질 단지를 리모델링)을 변경하거나 다른 히스톤의 잔류 물 (메틸 트랜스퍼 나있는, 즉 단백질의 아세틸을 수정하여 전이 활성) (트랜스 메커니즘) 5. 특정 염색질의 유전자 좌에서 별개의 PTM 패턴 클러스터는 별개의 사이트에서 다른 수정이 기본이되는 DNA의 기능 상태를 중재하는 분자 코드를 생성하는 시너지 효과를 수 있다는 가설의 고심을 주도하는 관찰. "히스톤 코드의 가설은"몇 년 동안 큰 공감대를 얻고있다하지만 실험적인 검증은 기술적 인 한계 6,7에 의해 다시 개최되었습니다.
질량 분석 (MS) 기반 프로테오믹스는로 떠오르고있다강력한 도구 히스톤 변형 패턴을 매핑하고, 염색질 결합 단백질 8의 특징을. MS는 펩티드의 이론 및 실험 질량 사이의 특정 Δmass로 변경을 감지합니다. 개별 히스톤의 수준에서, MS는 그 9-14 사이에서 새로운 수정과 계시 interplays의 검출을 허용, PTMS를 매핑하는 공정한하고 포괄적 인 방법을 제공한다.
최근, 전략의 숫자는 그대로 유사 분열 염색체 15, 수용성 hPTM 결합 단백질 16-18의 식별과 특정한 염색질 영역의 분리 및 분석의 특성을 포함하여 염색질의 프로테오믹스 조성물을 해부 개발되었다 (즉 말단 소립) 19, 20. 그러나, 히스톤 PTMS, 변형, 염색질 관련 단백질의 궤적 별 시너지 효과의 조사는 아직 불완전하다. 여기, 우리는 (ChroP라는 새로운 접근 방식을 설명우리는 효율적으로 기능 별개의 염색질 도메인의 특성을 개발하는 것이 색도 MATIN의 P의 roteomics) 21. 이 방법은 풍부한 샘플의 효율적인 MS 기반 단백체 분석을위한 크로 마틴 면역 침전 (칩), 후생 유전 학적 연구에 사용되는 잘 확립 된 프로토콜을 적응시킨다. 우리는 입력 및 MS에 의해 어드레싱 된 질문으로서 사용 염색질의 종류에 따라 두 가지 프로토콜을 개발 하였다; 특히 : MNase로 소화 고정되지 않은 기본 염색질의 1) 칩 모노 뉴 클레오을 정화하고 공동 연관 hPTMs (N-ChroP)를 해부하기 위해 사용된다; 2) 초음파에 의해 조각난 가교 염색질의 칩은 단백질 (X-ChroP)를 결합 모든 공동 농축 염색질의 특성을 SILAC 기반 interactomics 전략과 함께 사용됩니다. 우리는 여기에 면역 침전 단계에 대한 미끼로 H3K9me3를 사용하여, 이질 염색질을 풍부하게 공부에 대한 N-및 X-ChroP의 조합을 보여줍니다. ChroP의 사용은 연장 될 수있다따라서 후성 유전학의 다양한 응용 프로그램에 방법을 포장, 별개의 염색질에 지역, 또는 다른 기능 상태로 전환하는 동안 같은 지역 내에서 염색질 구성의 변화 중 하나를 공부합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 최근 ChroP, 염색질의 단백질 성분의 대규모 특성화 양적 전략을 설명 하였다. ChroP는 성적인 분야에서 사용되는 두 개의 보완적인 접근 방식, 칩과 MS, 자신의 강점에서 이익과 각각의 한계를 극복을 결합한다. 깊은 시퀀싱 (칩 – 시퀀서)에 결합 된 칩은 몇 가지 뉴 클레오 솜 (35)의 해상도에서 히스톤 수정의 게놈 전체의 매핑을 할 수 있습니다. 자신의 감성에 유리하지만, 항체 기반?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 원래 몰 세포 단백질 체학 (Proteomics)에 출판되었다. SOLDI M. 및 염색질 기능 영역의 Bonaldi T. 프로테오믹스 조사는 고유 이질 염색질 구성 요소 MCP 사이 소설 상승 작용을 보여준다. 2013; 64-80 : 12. © 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. 우리는 원고의 비판적 읽기 로베르타 Noberini (기술 및 IEO 이탈리아 연구소, 이탈리아) 감사합니다. TB의 작품은 지오반니 Armenise 하버드 재단 경력 개발 프로그램, 암 연구 및 건강의 이탈리아 정부에 대한 이탈리아 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다. MS의 작업은 FIRC 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
