이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
여러 세포 내 소기관으로 단백질을 단일 타겟하기 위하여, 식물은 일반적으로 중요한 유전자를 복제하고, 차동 촉진제 및 / 또는 신호 서열을 포함한 복잡한 규제 전략을 사용하여 개별적으로 각각의 유전자 표현. 대사 엔지니어와 특정 세포 기관에 효소를 표적에 관심이 합성 생물학은 도전에 직면하고 있습니다 : 하나 이상의 세포 기관에 국한되어 단백질의 경우, 엔지니어는 동일한 유전자를 여러 번 복제해야합니다. 이 작품은이 전략에 대한 솔루션을 제공합니다 :의 mRNA의 스 플라이 싱을 활용. 이 기술은 설립 엽록체와 퍼 옥시 대상 시퀀스를 활용하고 선택적으로 접합되어 하나의 mRNA로 결합. 일부 스플 라이스 변종은 세포질에 퍼 옥시 일부, 일부, 엽록체로 전송됩니다. 여기에 시스템은 여러 세포 기관이 스 플라이 싱 타겟팅을 위해 설계되었습니다. 이 작품에서는, GFP는 EXPR이 될 것으로 예상했다합리적으로 설계된 5 '의 mRNA 태그 일련의 엽록체, 세포질 및 페 록시에 essed. 이 태그는 이종 유전자가 여러 세포 내 소기관으로 표현 될 필요가있을 때 요구 복제의 양을 줄일 수있는 가능성이있다. 구문은 전작 11에 설계되었으며, 깁슨 조립체, 제한 효소를 필요로하지 않는 결찰 독립적 클로닝 방법을 사용하여 클로닝 하였다. 얻어진 플라스미드는 변형 된 유전자 총 프로토콜 benthamiana 표피 된 담배 잎 세포에 도입 하였다. 마지막으로, 형질 전환 된 잎은 공 초점 현미경으로 관찰 하였다.
서론
이 작품은 식물 세포가 여러 세포 기관에서 리포터 단백질을 발현하도록 설계하지만, 단 하나의 DNA 구조를 가진 것을 특징으로 대사 공학 / 합성 생물학 프로젝트입니다.
둘 이상의 위치로 단백질을 표적으로하는 하나의 접근법은 여러 복제 유전자 사본 다른 지역화 펩티드를 포함하는 각을 포함한다. 각 복사본은 하나의 변환 1을 역 교배에 의해, 또는 연속 재 변환에 의해 도입, 또는해야합니다. 이 추가 복제를 포함하고, 말단 당 하나의 지역화 태그에 의해 제한됩니다.
여러 위치에 단백질을 집중하는 또 다른 방법은 다른 접합 2-5을 통해서이다. RNA는 단일 유전자로부터 전사되지만, 전 사체의 다른 복사본은 셀 당 하나 이상의 방법으로 종종 다르게 처리된다. 이것은 단일 유전자로부터 전사 셀에 둘 이상의 메신저 RNA가 발생할 수있다. 이러한 다양한 MESSENGER RNA를 동일한 단백질의 상이한 이소 형을 위해 인코딩 또는 틀 이동, 모두 다른 단백질의 경우에 할 수있다. 대안적인 스 플라이 싱은 수년 동안 문헌에 기술되어 있지만, 작업 및 보존 공여체 및 수용체 스플 라이스 위치의기구는 더 최근 6 해명되고있다. 이 사이트는 더....
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프로토콜
대상으로 여러 세포 기관에 대한 대안 - 접합 시퀀스의 1. 디자인
- 최종 단백질 발현을위한 사이트를 확인합니다. 이 작품의 경우, 관심이 엽록체, 퍼 옥시 및 세포질을 대상으로합니다.
- 관심의 세포 기관에 단백질을 표적으로하는 것으로 알려진 단백질과 DNA 시퀀스를 식별하기 위해 문학을 사용합니다. 이 경우 엽록체는 애기 장대의 L-isoaspartate의 methyltransferase 6,15에서 순서를 대상으로하고, 애기 장대 트랜스 티 레틴 같은 S-알란토인 합성 효소 (16, 17)에게로부터 순서를 대상으로하는 페 록시가 결정되었다.
- 정확한 세포 기관의 관심 단백질을 대상으로해야 대안 - 스 플라이 싱 정권을 확인합니다. 자연 애기 시스템 6 관찰이 작품의 경우, 사이트를 접합. mRNA의 서열은 천연 스플 라이스 사이트를 떠나기 재 설계되었지만, 시퀀스는 인코딩 엽록체 또는 peroxis을 넣었다대안 - 접합 인트론 내 태그 (그림 1) 오메 타겟팅.
DNA 파트 2. 깁슨....
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결과
디자인 노력은 중요한 계획의 결과였다. 이 프로젝트에 대한 소설은 발현 된 단백질로 번역되는 사전의 mRNA를 만들 수있는 스 플라이 싱의 사용이다. 이들 단백질은,이 경우, 다른 세포 기관에서 발현되는 엽록체, 페 록시 및 / 또는 시토 졸. 우리는 선택적으로 6 접합되어 자연 애기 장대의 유전자를 적응하고, (TriTag-1과 TriTag-2) 대체 엑손의 시퀀스를 대상으로 엽록체 6 페 록시 17 알려진 배치했다. TriTag-3 엽록체 시퀀스의 복잡도가 낮은 영역 내에 포함 된 페 록시 신호로 구성된다. 이들은 GFP (그림 1) 프레임에 배치했다.
시퀀스 GFP를 표적 PIMT2 유전자 06 엽록체 및 페 록시로부터 네이티브 대안 접합 섭생 및 플라스미드 백본 : 본 연구에 사용 된 플라스미드 따라서 몇 가지 요소를 포함 하였다.......
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토론
본 연구에서는 단순한 전략은 식물의 여러 세포 구획에 단일 유전자 변형 단백질을 지역화에 대해 설명합니다. 목표는 담배 benthamiana에 하나 이상의 소기관으로 단일 유전자를 발현 할 구조물을 설계하는 것이었다. 전략은 합리적 GFP 기반의 DNA 구조의 설계, 깁슨 조립, 유전자 총을 가진 잎의 세포에 플라스미드의 전달 및 공 초점 현미경과 결과의 관찰이 (가) 있습니다.
세 가지 짧은, N-말단 태그 (11)를 대상으로 동시 엽록체, 퍼 옥시과 세포질을 위해 설계되었습니다. 이러한 "TriTags"는 엽록체 플러스 세포질 6 퍼 옥시 플러스 세포질 (17) 중 하나에 인코딩 된 단백질을 직접 선택적으로 접합의 mRNA를 인코딩하는 자연 발생의 DNA를 결합하여 설계되었다. TriTag-3 플라이 싱에 의존하고있는 NA 엽록체 대상 시퀀스로 구성하지 않는turally 구조화되지.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 담배 benthamiana 모종의 관대 한 기부에 대한 매사 추세 츠 종합 병원의 젠 쉰에게 감사의 말씀을 전합니다. 젠 부시 대통령은 식물 성장 및 성장 챔버 영역을 설정하는 조언에 크게 도움을주었습니다. Wyss 다음 연구소의 톰 Ferrante의 공 초점 현미경에 중요한 도움을 제공했다. 저자는 특히 보스턴 아동 병원의 돈 Ingber과 유전자 총과 관련된 공급의 관대 한 기부에 대한 Wyss 다음에 연구원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 프로젝트에 대한 자금 조달은 PAS, JCW 및 MDM에 대한 에너지 고급 연구 프로젝트 기관의 부 (ARPA-E 상 # DE-000079)와 협력 계약을 통해 제공되며, Chimerion 생명 공학, 주식 회사를 통해 MJV에 대한했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 올리고뉴클레오티드 프라이머 | IDT | (맞춤형) | GeneBlocks |
| IDT | (맞춤형) | 500bp 올리고뉴클레오티드 | |
| ApE 소프트웨어 | U Utah | (다운로드) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute 키트 | Qiagen | 28004 | PCR 제품 정제에 사용 |
| QIAprep 스핀 miniprep 키트 | Qiagen | 27104 | 가진 플라스미드 |
| Phusion 마스터 믹스 | NEB | M0532S | 관심 유전자를 PCR 증폭하는 데 사용 |
| Gibson 어셈블리 반응 믹스 | NEB | E2611L | 다음 9 가지 성분의 마스터 믹스 |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson 어셈블리 믹스 |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson 어셈블리 믹스 |
| dNTP 믹스 | Fermentas | R0192 | Gibson 어셈블리 믹스 |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson 어셈블리 믹스 |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson 어셈블리 믹스 |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson 어셈블리 믹스 |
| T5 엑소뉴클레아제 | 진원지 | T5E4111K | Gibson 조립 혼합물 |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | 계산 단순화를 위한 웹사이트 | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | 유전자 총 총알의 DNA를 준비하는 데 사용 |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | 필요한 모든 부품 포함 |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| 컨포칼 현미경 | Leica | SP5 X MP | 결과 세포의 이미징 |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | 컨포칼 이미징에 사용 |
| 플라스미드 편집기(ApE) | 유타 | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:결찰 계산기 | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
참고문헌
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A.
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재인쇄 및 허가
