Imaging Gennem puppe Case of<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Dette dokument viser anvendelsen af en hurtig konfokalt mikroskop billedet celle adfærd direkte gennem puparium. Ved at lade puppe tilfælde intakt, giver denne metode observation og måling af dynamiske celleprocesser i en fase af Drosophila udvikling, der er vanskeligt at studere direkte.
Abstract
Den mangeårige brug af Drosophila som model for celle-og udviklingsmæssige biologi har givet en bred vifte af værktøjer. Sammen har disse teknikker aktiveret analyse af celle-og udviklingsmæssige biologi fra en række forskellige metodiske vinkler. Live-billeddannelse er en ny metode til at observere dynamiske celle processer såsom celledeling eller celle motilitet. Efter at have isoleret mutationer i uncharacterized formodede cellecyklusproteiner det blev vigtigt at overholde mitose in situ ved hjælp af direkte billedvisning. De fleste levende billeddiagnostiske undersøgelser i Drosophila har fokuseret på fosterstadiet, der er tilgængelige for manipulation og observation på grund af deres lille størrelse og optisk klarhed. Men i disse faser af cellecyklus er usædvanligt ved, at det mangler en af de gap faser eller begge dele. Derimod celler af puppe fløj af Drosophila har en typisk cellecyklus og gennemgå en periode med hurtig mitose spænder 20 timer af puppe udvikling. Det er let at jegdentify og isolere pupper af den pågældende fase at fange mitose in situ. Montering intakt pupper forudsat den bedste kombination af medgørlighed og holdbarhed under billedbehandling, så eksperimenter for at køre i flere timer med minimal indvirkning på celle-og dyre-levedygtighed. Fremgangsmåden tillader observation af funktioner så lille som, eller mindre end, flyve kromosomer. Justering af mikroskop indstillinger og detaljerne i montage, tillod udvidelse af præparatet til at visualisere membran dynamik tilstødende celler og fluorescens-mærkede proteiner såsom tubulin. Denne metode virker for alle testede fluorescerende proteiner og kan fange submicron skala funktioner over en bred vifte af tidsskalaer. Mens begrænset til den ydre 20 um puppe med et konventionelt konfokalt mikroskop, kan denne tilgang til at observere protein og cellulære dynamik puppe væv in vivo generelt være nyttige i studiet af cellen og udviklingsmæssige biologi i disse væv.
Introduction
Den eddike flyve, Drosophila melanogaster, er en veletableret model til at studere mange aspekter af biologi. Drosophila forskning har en rig historie af genetiske eksperimenter, der tillader sofistikerede former for genmanipulation, herunder ytringsfrihed, knockdown og mutation. Med fremkomsten af fluorescerende mærker protein, har dette repertoire udvidet til at omfatte undersøgelser af celler og proteiner i levende dyr. Fluen embryo er et glimrende system til sådanne undersøgelser, som det er lille og optisk klar tillader dyb, høj opløsning billeddannelse in vivo 1-3. Andre stadier af flue udvikling har vist sig at være mindre medgørlig, der kræver bedøvelse 4, dissektion og kortsigtet kultur 5,6, eller oprettelsen af vinduer i neglebånd til billeddannelse 7,8. Disse manipulationer normalt kompromittere udviklingen dyr på lang sigt eller påvirke dyr på måder, der begrænser billedbehandling til korte perioder.
ent "> At studere nye mutationer i gener, der ligner cellecyklus regulatorer, var det nødvendigt at finde en passende forberedelse til at studere timingen og troskab af cellecyklus. Da de fleste embryonale cellecykler bliver afkortet (SM eller S-G2-M) og mutanterne under undersøgelse ikke viser fejl i senere stadier, var det vigtigt at overholde cellecyklussen i puppestadiet væv. Epitelceller i puppe har en mere typisk G1-S-G2-M cellecyklus og pupper af denne fase er ikke kan muskelbevægelser 9. Den oprindelige udgangspunkt for manipulationer medtaget intakt hele pupper udtrykker Histone2AV-GFP. Trods den tilsyneladende opaciteten af puppe tilfælde dette intakt præparat vist sig at være fremragende til langvarig in vivo-billeddannelse. Denne teknik er enkel nok, at bachelor-forskere rutinemæssigt bruger det til at studere aspekter af celle-og udviklingsmæssige biologi i Drosophila og alligevel opløsningen er fint nok til at tillade diskrimination af mikrometer skala funktioner. Med denne metode er mulige observationer af begivenheder over timer, minutter eller sekunder blot ved at justere tidsrække parametre. Videoer ved hjælp af blå, grøn, gul, orange og røde fluorescerende proteiner, eller kombinationer af disse, er blevet foretaget. Vigtigere er, hvis draget omsorg for at minimere laser intensitet, selv langsigtede billeddannelse har ingen effekt på udvikling eller levedygtighed af dyrene.Protocol
Representative Results
Discussion
At visualisere, måle og kvantificere funktioner i delende celler, der kræves udvikling af en enkel bearbejdning for at observere mitose i levende puppe fløj af Drosophila ved hjælp af konfokal analyse af His2AvGFP udtrykkende celler. Denne metode blev anvendt til at dokumentere, at cellecyklus i puppe fløj bærer stærke ligheder med cellecykler i pseudostratified epiteler i at kerner flytte til den apikale overflade af epitel hvor de kommer ind mitose. Efter telofase, kerner falde tilbage i epitellaget. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at anerkende Akira Chiba for intellektuel støtte, materiel støtte, og lagre. Tak til Julia Dallman for kommentarer.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
