Brain Slice Biotinylering: En<em> Ex Vivo</em> Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner
Summary
Neuronal membran menneskehandel dynamisk styrer plasmamembranprotein tilgængelighed og markant indvirkning neurotransmission. Til dato har det været en udfordring at måle neuronal endocytisk handel med voksne neuroner. Her beskriver vi en meget effektiv, kvantitativ metode til måling af hurtige ændringer i overfladeprotein ekspression ex vivo i akutte hjernesnit.
Abstract
Reguleret endocytisk menneskehandel er den centrale mekanisme letter en række neuromodulatory begivenheder, ved dynamisk styring af receptoren, ionkanal, og transportør celleoverfladen præsentation på et minut tidsskala. Der er en bred mangfoldighed af mekanismer, der styrer endocytisk handel med enkelte proteiner. Studier, der undersøger de molekylære fundament for menneskehandel har primært påberåbes overflade biotinyleringen til kvantitativ måling af ændringer i membran-protein overflade udtryk som reaktion på eksogene stimuli og genmanipulation. Imidlertid har denne tilgang hovedsagelig været begrænset til dyrkede celler, som måske ikke et retvisende billede af fysiologisk relevante mekanismer på spil i voksne neuroner. Desuden kan dyrkede celle tilgange undervurdere regionsspecifikke forskelle i mekanismerne smuglerruter. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der strækker celleoverflade biotinylering den akutte hjernesnit forberedelse. Vipåvise, at denne metode giver et high-fidelity tilgang til måling af hurtige ændringer i membran protein overflade niveauer i voksne neuroner. Denne tilgang vil sandsynligvis have bred anvendelighed inden for neuronale endocytisk menneskehandel.
Introduction
Endocytisk menneskehandel er en allestedsnærværende cellulære mekanisme, der finjusterer plasmamembranen præsentationen af en række integrerede membranproteiner. Endocytose leverer vigtige næringsstoffer til det intracellulære miljø 1 og desensibiliserer receptor signalering som respons på receptor-aktivering 2. Endocytic genbrug tilbage til plasmamembranen kan desuden forbedre cellulær signalering ved at øge protein-ekspressionsniveauer på celleoverfladen 3. Desuden er forstyrrelser membran trafficking impliceret i talrige sygdomme og patologiske tilstande 4,5, understreger behovet for at undersøge de molekylære mekanismer, der styrer protein endocytic menneskehandel. Mens mange proteiner udnytte klassiske clathrin-afhængige internalisering mekanismer, montering beviser i løbet af de sidste mange år, viser, at flere clathrin-uafhængig endocytiske mekanismer regulerer endocytiske potentiale et stigende udbud afproteiner 6,7. Således har behovet for at undersøge endocytiske mekanismer, der letter handel med fysiologiske relevante systemer vokset betydeligt.
I hjernen endocytiske handel med receptorer, ionkanaler og neurotransmitter transportere har en primær rolle i etableringen af synaptisk plasticitet 8-11 og reaktion på misbrugsstoffer 12-15, i sidste ende påvirker neuronal excitabilitet og synaptiske reaktioner. Til dato hovedparten af undersøgelserne neuronale menneskehandel stole på enten heterolog ekspression systemer eller dyrkede primære neuroner, kan hverken som pålideligt afspejle mekanismer på spil i voksne neuroner. Her rapporterer vi en tilgang, der bruger overflade biotinyleringen til kvantitativ måling af overflade protein niveauer i akut hjernen skiver stammer fra voksne gnavere. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi præsenterer data, der viser, at musen striatale dopamin-transporteren hurtigt internaliserer i respons at phorbolester-medierede proteinkinase C (PKC) aktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trods mangeårige viden, endocytisk handel kritisk påvirkninger synaptisk signalering i hjernen, har det vist sig udfordrende til kvantitativ måling af ændringer i protein-overflade udtryk hos voksne neuroner. I dette arbejde rapporterer vi en pålidelig metode til at mærke overfladeprotein ex vivo i akutte hjernesnit. Brain skive præparater har en mangeårig historie af nytte for elektrofysiologiske optagelser, da de opretholder synaptiske forbindelser og celle levedygtighed op til timer efter tilvirkning…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud DA15169 og DA035224 til HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
