Cerebro Slice Biotinilación: Una<em> Ex Vivo</em> Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas
Summary
El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.
Abstract
Endocítica tráfico regulado es el mecanismo central facilitar una variedad de eventos neuromoduladores, mediante el control de forma dinámica del receptor, canal de iones, transportador y presentación de la superficie celular en una escala de tiempo de minutos. Hay una gran diversidad de mecanismos que controlan el tráfico endocítica de las proteínas individuales. Los estudios que investigan las bases moleculares de la trata se han basado principalmente en la superficie de biotinilación para medir cuantitativamente los cambios en la expresión de proteínas de superficie de membrana en respuesta a estímulos exógenos y la manipulación genética. Sin embargo, este enfoque se ha limitado principalmente a las células cultivadas, que pueden no reflejar fielmente los mecanismos fisiológicamente relevantes en juego en las neuronas adultas. Por otra parte, los enfoques de células cultivadas pueden subestimar las diferencias específicas de la región en los mecanismos de la trata. Aquí se describe un enfoque que se extiende biotinilación superficie de la célula a la preparación de cortes de cerebro aguda. Nosotrosdemuestran que este método ofrece un enfoque de alta fidelidad para medir los cambios rápidos en los niveles de proteínas de superficie de membrana en las neuronas adultas. Este enfoque es probable que tenga una amplia utilidad en el ámbito del tráfico neuronal endocítica.
Introduction
Endocítica tráfico es un mecanismo celular ubicua que afina la presentación membrana plasmática de una variedad de proteínas integrales de membrana. Endocitosis proporciona nutrientes vitales para el medio intracelular 1 y desensibiliza la señalización del receptor en respuesta a la activación del receptor 2. Endocítica reciclar de nuevo a la membrana de plasma puede mejorar adicionalmente la señalización celular mediante el aumento de los niveles de expresión de proteínas en la superficie celular 3. Por otra parte, las perturbaciones de transporte de membrana están implicadas en numerosas enfermedades y condiciones patológicas 4,5, haciendo hincapié en la necesidad de investigar los mecanismos moleculares que regulan el tráfico de proteínas endocítica. Mientras que muchas proteínas utilizan mecanismos de internalización clásicos clatrina dependiente, pruebas de montaje en los últimos años demuestra que los múltiples mecanismos de endocitosis clathrin independiente gobiernan el potencial endocítica de un conjunto cada vez mayor deproteínas 6,7. Por lo tanto, la necesidad de investigar los mecanismos de endocitosis que favorecen la trata en los sistemas fisiológicos relevantes ha crecido considerablemente.
En el cerebro, el tráfico endocítica de receptores, canales iónicos y transportadores de neurotransmisores tiene un papel principal en el establecimiento de la plasticidad sináptica 8-11 y la respuesta a drogas de abuso 12-15, en última instancia afectan a la excitabilidad neuronal y las respuestas sinápticas. Hasta la fecha la mayoría de los estudios de tráfico neuronales, apoyarse en los sistemas de expresión heterólogos o neuronas en cultivo primario, ninguno de los cuales puede reflejar de forma fiable los mecanismos en juego en las neuronas adultas. Aquí, se presenta un enfoque que utiliza biotinilación superficie para medir cuantitativamente los niveles de proteína de superficie en rodajas de cerebro agudas derivadas de roedores adultos. Con este enfoque, se presentan datos que demuestran que el ratón estriatal de dopamina transportador internaliza rápidamente en rerespuesta a forbol éster mediada por la activación de la proteína quinasa C (PKC).
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar del conocimiento de muchos años que el tráfico endocítica críticamente impactos de señalización sináptica en el cerebro, que ha resultado ser un desafío para medir cuantitativamente los cambios en la expresión de superficie de la proteína en las neuronas adultas. En este trabajo, se presenta un enfoque fiable para etiquetar proteína de la superficie ex vivo en rodajas de cerebro agudas. Preparaciones de cortes de cerebro tienen una larga historia de utilidad para los registros electrofisioló…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones DA15169 y DA035224 en HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
