यहाँ, हम मानव की जैविक सुविधाओं पुनरावृत्ति जो अनुमोदक संस्कृति परिस्थितियों में सिकुड़ा myofibers (myospheres) के तीन आयामी फार्म समूहों है कि कंकाल की मांसपेशी progenitors के एक सजातीय जनसंख्या पैदा करने की ओर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) के epigenetic reprogramming पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन कंकाल की मांसपेशियों.
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं का एक सजातीय और प्रचुर मात्रा में आबादी की पीढ़ी के सेल आधारित चिकित्सा के लिए और मानव neuromuscular बीमारियों का मॉडल एक "एक थाली में रोग" के लिए एक आवश्यकता है. ऐसे कम बहुतायत और ब्याज की आबादी है, साथ ही तीन आयामी सिकुड़ा संरचनाओं के गठन के लिए प्रोटोकॉल की कमी की विविधता के रूप में प्रमुख बाधा, neuromuscular विकारों के लिए स्टेम सेल के आवेदन सीमित है. हम hESCs में परिभाषित कारकों के अस्थानिक लागू होने से इन सीमाओं पर काबू पा कि एक प्रोटोकॉल तैयार की है – पेशी दृढ़ संकल्प कारक MyoD और श्रृंगार / एसएनएफ chromatin जटिल घटक BAF60C remodeling – कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में hESCs reprogram करने में सक्षम हैं. यहाँ हम प्रोटोकॉल hESC व्युत्पन्न myoblasts पैदा करते हैं और निरीक्षण छोटी संरचनाओं (myospheres) में अपने क्लस्टरिंग बढ़ावा देने की स्थापना का वर्णन है कि कार्यात्मक नकल छोटी कंकाल की मांसपेशियों 7 </sup>.
Pluripotency बनाए रखते हुए, क्योंकि उनके अद्वितीय क्षमता का स्वयं को नवीनीकृत, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) पुनर्योजी चिकित्सा में एक अमूल्य संसाधन माना जाता है. इन विट्रो रोग मॉडलिंग के लिए कंकाल की मांसपेशियों के रोगग्रस्त मांसपेशियों और hESC या प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के सेल की मध्यस्थता repopulation स्टेम (iPSC) व्युत्पन्न पीढ़ी उपचार की पहचान करने और कई neuromuscular रोग के रोगजनन elucidating के उद्देश्य से अध्ययन के प्रमुख लक्ष्य हैं. हालांकि, इन अध्ययनों कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए hESCs के प्रतिरोध से और कंकाल myogenesis की ओर hESC-प्रतिबद्धता की आणविक विनियमन के बारे में जानकारी की कमी से चुनौती दी गई है. दरअसल, hESCs से कंकाल की मांसपेशी पूर्वज उत्पन्न करने के लिए पिछले प्रयास केवल embryoid शरीर (ईबी) व्युत्पन्न progenies या mesenchymal कोशिकाओं ट्रांसक्रिप्शनल activators के अस्थानिक अभिव्यक्ति (निम्न कंकाल myogenesis सक्रिय करने के लिए सक्षम हैं पता चला है कि जैसेPax3 या Myf5) 1-3 या विशिष्ट संस्कृति शर्तों 4-5 के लिए जोखिम के.
हम पहले (SMARCD3 द्वारा इनकोडिंग) श्रृंगार / एसएनएफ घटक, BAF60C, मांसपेशी विशेष loci 6 की MyoD की मध्यस्थता सक्रियण की अनुमति देता है कि transcriptional मशीनरी का एक अनिवार्य घटक है कि पता चला है. हमने हाल ही में BAF60C के चुनिंदा अभाव hESCs पर अन्यथा दैहिक कोशिकाओं 8-10 व्यक्त BAF60C में मनाया जाता है कि कंकाल myogenesis 7 के MyoD की मध्यस्थता सक्रियण के लिए प्रतिरोध प्रदान पता चला है कि, एक प्रक्रिया सामान्यतः के रूप में myogenic रूपांतरण करने के लिए भेजा. BAF60C के लिए मजबूर अभिव्यक्ति सीधे BAF60C और myogenic वंश 7 की ओर hESCs करता है कि एक epigenetic हस्ताक्षर भव्य MyoD साथ, विशिष्ट संस्कृति शर्तों पर, hESCs में कंकाल myogenesis सक्रिय करने के लिए MyoD सक्षम बनाता है. ध्यान से, पिछले प्रोटिओमिक विश्लेषण BAF6 के चुनिंदा अनुपस्थिति का पता चला0C, श्रृंगार / एसएनएफ घटकों के बीच, ESCs 11 में. हम तीन आयामी सिकुड़ा फार्म के लिए एकत्रित किया जा सकता है कि कंकाल myoblasts का एक सजातीय जनसंख्या की पीढ़ी के लिए अग्रणी myogenic वंश पर hESCs के एक epigenetic प्रतिबद्धता लागू करने के लिए इस ज्ञान का उपयोग किया संरचनाओं (myospheres) कि कार्यात्मक नकल छोटी कंकाल की मांसपेशियों 7. दरअसल, hESCs से कंकाल की मांसपेशी पूर्वज पैदा करने की हमारी विधि जैसे सेल कोशिकाओं भेदभाव संकेतों को उजागर कर रहे हैं जब तक phenotypically अव्यक्त है जो myogenic वंश, के लिए hESCs के epigenetic प्रतिबद्धता पर निर्भर करता है भेदभाव मध्यम में एकत्रीकरण और संस्कृति (विशिष्ट प्रोटोकॉल देखें). इस रणनीति epigenetically कंकाल की मांसपेशी वंश के लिए प्रतिबद्ध है और ऊतकीय और कंकाल के कार्यात्मक संपत्तियों पुनरावृत्ति कि तीन आयामी सिकुड़ा myospheres के गठन के लिए उपयुक्त हैं hESCs के एक सजातीय आबादी के विस्तार के परमिटमांसपेशियों. myospheres पेशी रोगों का मॉडल एक "एक थाली में रोग" के लिए दोहन छोटी मांसपेशियों का पहला सबूत प्रदान करते हैं. रोगी व्युत्पन्न iPSCs से उत्पन्न करते हैं, तो इन myospheres चिकित्सकीय यौगिकों के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक उपकरण के रूप में जबरदस्त क्षमता की पेशकश के अलावा, लम्बे समय से विकास संबंधी सवालों को स्पष्ट करने की क्षमता और दुर्लभ रोगों के रोगजनन है. हम भी गोम्स एट अल. 12 से एक जौव प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में myosphere विश्लेषण का एक तत्काल readout, वर्गों पर immunohistochemistry द्वारा प्रदान किया जा सकता है कि ध्यान दें
यहाँ प्रस्तावित प्रोटोकॉल सीधे hESCs से सिकुड़ा myofibers (myospheres) के तीन आयामी समूहों उत्पन्न करने के लिए कैसे करें. प्रस्तावित रणनीति स्क्रीनिंग assays और विकास अध्ययन के लिए दोनों मॉडल "एक थाली में रोग" एक के रूप में उपयुक्त हो सकता है कि निलंबन में छोटा मांसपेशियों का निर्माण करने के अभूतपूर्व और असाधारण क्षमता है. इसके अलावा, hESCs से myospheres उत्पन्न करने के लिए विधि सरल है और आम तौर पर बरामद कोशिकाओं की उपज पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है जो भेदभाव के दौरान किसी भी FACS छँटाई कदम, की आवश्यकता नहीं है. यह एकल कक्षों में ईबी की एक हदबंदी का तात्पर्य के बाद इसके अलावा, भेदभाव के दौरान एक छँटाई प्रक्रिया एकत्रीकरण के साथ हस्तक्षेप करेगा.
प्रस्तावित विधि pluripotent भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में व्यक्त नहीं कर रहे हैं जो विशिष्ट कारकों, MyoD और BaAF60C, साथ hESCs के epigenetic reprograming पर आधारित है. MyoD और BAF60C "मूल" प्रोटीन जटिल वें प्रदाननिशान पर प्रतिलेखन कंकाल myogenic कार्यक्रम को सक्रिय करने के लिए आय जिसमें से जीनोमिक loci. दो कारकों lentiviral संक्रमण के माध्यम से कोशिकाओं को दिया और यह सभी कोशिकाओं में दोनों कारकों के संक्रमण के एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है रहे हैं. इस उच्च टिटर वायरस या चयन मार्कर के साथ संपन्न वायरस का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. संस्कृति की स्थिति भी myogenic भेदभाव की हद अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. कंकाल myotubes में myogenic व्यापारियों का रूपांतरण प्राप्त करने के लिए – हम सीरम मुक्त परिभाषित मध्यम में ऊष्मायन (आईटीएस इंसुलिन transferrin युक्त) द्वारा पीछा myogenic व्यापारियों के समूहों में hESCs व्यक्त MyoD/BAF60C के भेदभाव के लिए एक सीरम आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल, प्रस्ताव. हालांकि, यह अन्य परिभाषित मीडिया एक समान या बेहतर myogenic भेदभाव को प्राप्त कर सकते हैं कि संभव है. प्रोटोकॉल के एक वर्तमान सीमा है कि यह इसके अलावा जो होते हैं, भ्रूण गोजातीय सीरम, के उपयोग पर निर्भर करता हैकई पशु प्रोटीन और पदार्थ आईएनजी, बहुत से बहुत विविधताओं से पता चलता है. इस myospheres भीतर myogenic रूपांतरण की कम क्षमता या विविधता में हो सकता है. ध्यान से, BAF60/MyoD-expressing hESCs से प्राप्त सभी ईबी संरचनाओं की तरह myospheres नहीं कर रहे हैं; अर्थात्, कुछ पूरी तरह से myofibers से बना ईबी तरह समुच्चय हैं. (परिणाम देखें) प्रोटोकॉल के अंत में प्रदर्शन ईबी वर्गों पर immunostaining द्वारा अनुमानित रूप में सामान्य रूप से BAF60C और MyoD व्यक्त hESCs से व्युत्पन्न myospheres की संख्या 30 से 60% से भिन्न हो सकती हैं. केवल myospheres के लिए एक संस्कृति डिश को समृद्ध करने के लिए एक संभावित दृष्टिकोण एक myogenic संवाददाता का उपयोग किया जाएगा. यह आंशिक रूप से या नहीं विभेदित ईबी की तरह समूहों discarding और केवल myospheres चयन में सुविधा होगी.
अन्त में, पेश कारकों के अस्थायी आवश्यकताओं अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ प्रसव की विधि में सुधार के लिए उपयोगी होगा. उदाहरण के लिए, अगर BAF60C और MyoD केवल श के लिए आवश्यक हैंort समय सही दिशा में "किक" कोशिकाओं को संशोधित mRNA वितरण पर आधारित विधियों लागू किया जा सकता है. कारकों कोशिकाओं उनके अंतर्जात प्रोटीन का फायदा उठाने से पहले एक लंबे समय के लिए आवश्यक हैं अगर इसके विपरीत, एक episomal दृष्टिकोण परिवर्तनशीलता और जीनोम में एकीकरण के कारण अनियंत्रित प्रभाव को खत्म करने की सिफारिश की जाएगी. अंत में, हम यह पिछले कंकाल की मांसपेशियों में hESC रूपांतरण प्राप्त करने के लिए या MyoD (कभी नहीं के बाद) के रूप में एक ही समय में BAF60C व्यक्त करने के लिए अनिवार्य है कि ध्यान दें. BAF60C की पूर्व अभिव्यक्ति के लिए आवश्यकता संभवतः जीनोम 6,15 के माध्यम से उचित MyoD chromatin वितरण के लिए epigenetic परिदृश्य पूर्व स्थापित करने में अपनी भूमिका पर निर्भर करता है. जैसे, भविष्य प्रोटोकॉल यौगिकों या hESCs में BAF60C अभिव्यक्ति का प्रचार करने वाले अन्य जोड़तोड़ द्वारा सुधार किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
पीएलपी सैनफोर्ड बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान केंद्र के एसोसिएट अन्वेषक है. R01AR056712, R01AR052779 और गठिया और Musculoskeletal स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान और त्वचा रोग (NIAMS), एमडीए और सैनफोर्ड बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार से P30 AR061303: यह काम पीएलपी के लिए निम्न अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है. इस काम आंशिक रूप से परियोजना में यूरोपीय समुदाय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से अनुसंधान के वित्तपोषण से लाभ हुआ है FP7 स्वास्थ्य – 2009 ENDOSTEM 241440 (मरम्मत और मांसपेशियों के ऊतकों के रखरखाव के लिए vasculature जुड़े स्टेम कोशिकाओं और मांसपेशियों में स्टेम कोशिकाओं की सक्रियता) एसए द्वारा समर्थित किया गया. सीआईआरएम फैलोशिप.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |