Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.
Generatie van een homogene en overvloedige bevolking van spiercellen van humane embryonale stamcellen (hESCs) is een vereiste voor celtherapieën en een "ziekte in een schotel" model van menselijke neuromusculaire ziekten. Belangrijke hindernissen, zoals een lage dichtheid en heterogeniteit van de bevolking van belang, evenals een gebrek aan protocollen voor de vorming van drie-dimensionale contractiele structuren, zijn de toepassingen van stamcellen beperkt voor neuromusculaire aandoeningen. We hebben een protocol dat deze grenzen overwint door ectopische introductie van bepaalde factoren in hESCs ontworpen – de bepaling spier factor MyoD en SWI / SNF chromatine remodeling complex component BAF60C – die in staat zijn om hESCs herprogrammeren in skeletachtige spiercellen. Hier beschrijven we het protocol opgericht om hESC afgeleide myoblasts genereren en hun clustering te bevorderen tot driedimensionele geminiaturiseerde structuren (myospheres) die functioneel mimic geminiaturiseerde skeletspieren 7 </sup>.
Vanwege hun unieke vermogen om zichzelf te vernieuwen met behoud pluripotency worden menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) beschouwd als een bron van onschatbare waarde in de regeneratieve geneeskunde. Stamcel-gemedieerde herbevolking van zieke spieren en hESC-of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide generatie van skeletspieren voor in vitro ziektemodel zijn de belangrijkste doelen van studies gericht op het identificeren behandelingen en het ophelderen van de pathogenese van vele neuromusculaire ziekten. Echter, deze studies zijn uitgedaagd door de weerstand van hESC 's om te zetten in de skeletspier cellen en door het gebrek aan informatie over de moleculaire regulatie van hESC-inzet in de richting van het skelet myogenese. Inderdaad, eerdere pogingen om de skeletspieren voorlopers genereren uit hESCs blijkt dat slechts embryoid lichaam (EB)-afgeleide nakomelingen of mesenchymale cellen zijn bevoegd om het skelet myogenesis volgende ectopische expressie van transcriptieactivatoren (activeren bv.Pax3 of Myf5) 1-3 of door blootstelling aan specifieke kweekomstandigheden 4-5.
We hebben eerder aangetoond dat de component SWI / SNF, BAF60C (gecodeerd door SMARCD3), is een essentieel onderdeel van het transcriptieapparaat dat MyoD-gemedieerde activatie van spier-specifieke loci 6 toelaat. We hebben onlangs ontdekt dat de selectieve geen BAF60C verleent op hESCs de weerstand tegen MyoD gemedieerde activering van skelet myogenesis 7 die anders wordt waargenomen in BAF60C expressie somatische cellen 8-10, een proces gewoonlijk aangeduid als myogene conversie. Gedwongen expressie van BAF60C stelt MyoD om skelet myogenesis direct activeren in hESCs, op specifieke kweekomstandigheden, met BAF60C en MyoD het opleggen van een epigenetische handtekening die hESCs begaat jegens de myogene lijn 7. Van de nota, vorige proteomics analyse bleek de selectieve afwezigheid van BAF60C onder de SWI / SNF componenten in SER 11. We gebruikten deze kennis een epigenetische inzet van hESCs leggen op de myogene lineage, leidt tot de vorming van een homogene populatie van skeletmyoblasten die kunnen worden samengevoegd om driedimensionale vormen contractiele structuren (myospheres) die functioneel nabootsen geminiaturiseerde skeletspieren 7. inderdaad onze werkwijze voor het genereren skeletspier progenitoren hESCs voert de epigenetische inzet van hESCs de myogene lijn, die fenotypisch tot latente cellen worden blootgesteld aan differentiatiesignalen, zoals mobiele aggregatie en cultuur in differentiatie medium (zie specifiek protocol). Deze strategie maakt de uitbreiding van een homogene populatie van hESCs die epigenetisch zich inzetten voor skeletspieren afstamming en geschikt om de vorming van drie-dimensionale contractiele myospheres dat histologische en functionele eigenschappen van het skelet recapitulerenspieren. De myospheres bieden het eerste bewijs van geminiaturiseerde spieren exploiteerbare voor een "ziekte in een schotel"-model van spierziekten. Wanneer gegenereerd van patiënt afgeleid iPSCs, deze myospheres hebben het potentieel om langdurige ontwikkelings vragen verhelderen en de pathogenese van zeldzame ziekten, naast het aanbieden van het enorme potentieel als een instrument voor high throughput screening van therapeutische verbindingen. We merken ook op dat een directe uitlezing van myosphere analyse zou worden door immunohistochemie op punten, zoals beschreven in een Jupiter protocol Gomes et al.. 12
De hier voorgestelde protocol beschrijft hoe driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres) genereren direct uit hESCs. De voorgestelde strategie heeft de ongekende en buitengewone potentieel om mini spieren in suspensie die geschikt is als kan worden "ziekte in een schotel"-model voor zowel screening assays en ontwikkelingsstudies produceren. Bovendien is de methode myospheres genereren uit hESCs is eenvoudig en vereist geen FACS-sortering stap tijdens de differentiatie, die doorgaans een negatieve invloed op de opbrengst van teruggewonnen cellen vereisen. Bovendien zou een sorteerprocedure tijdens de differentiatie interfereren met de aggregatie omdat dit betekent een dissociatie van de EB in enkele cellen.
De voorgestelde methode is gebaseerd op de epigenetische reprograming hESCs van een bepaalde parameter, MyoD en BaAF60C, die niet uitgedrukt in pluripotente embryonale stamcellen. MyoD en BAF60C over een "kern" eiwitcomplex thbij markeert de genomische loci waaruit transcriptie overgaat tot het skelet myogene programma te activeren. De twee factoren zijn om de cellen uit met behulp van lentivirale infecties en daarom essentieel om een hoge efficiëntie van infectie van beide factoren in alle cellen te verkrijgen. Dit kan worden bereikt door gebruik van hoge titer virussen of virussen voorzien van selectiemerkers. Kweekomstandigheden een belangrijke rol spelen bij het optimaliseren van de omvang van de myogene differentiatie. Wij stellen een serum op basis van differentiatie protocol voor de differentiatie van MyoD/BAF60C uiten hESCs in clusters van myogene voorlopers, gevolgd door incubatie in serum-vrij gedefinieerde medium (die insuline transferrine – ITS) om de conversie van myogene voorlopers bereiken in skeletachtige myotubes. Het is echter mogelijk dat andere gedefinieerde media gelijke of betere myogene differentiatie kan bereiken. Een stroombegrenzing van het protocol is dat het gebaseerd is op het gebruik van foetaal runderserum, die naast bevattening veel dierlijke eiwitten en stoffen, toont veel te veel variaties. Dit kan resulteren in lagere efficiëntie of heterogeniteit van myogene conversie binnen myospheres. Van de nota, niet alle EB-achtige structuren afgeleid van BAF60/MyoD-expressing hESCs zijn myospheres; namelijk, sommige zijn EB-achtige aggregaten volledig samengesteld uit myovezels. Het aantal myospheres normaal afgeleid van hESCs uiten BAF60C en MyoD kan variëren van 30 tot 60% zoals geschat door immuunkleuring op EB secties uitgevoerd aan het einde van het protocol (zie resultaten). Een mogelijke benadering van een kweekschaal voor slechts myospheres verrijking zou een myogene reporter gebruikt. Dit vergemakkelijkt het teruggooien van het gedeeltelijk of niet gedifferentieerd EB-achtige clusters en selecteren alleen de myospheres.
Tenslotte zou een beter begrip van de mechanismen verantwoordelijk voor de temporele eisen van de factoren geïntroduceerd nuttig om de wijze van levering verbeteren. Bijvoorbeeld, als BAF60C en MyoD zijn alleen vereist voor short tijd "kick" cellen in de juiste richting, werkwijzen op basis van gemodificeerde mRNA aflevering kunnen worden toegepast. Wanneer daarentegen de elementen nodig voor een langere tijd voordat de cellen hun endogene eiwitten exploiteren, een episomaal aanpak worden aanbevolen om variabiliteit en ongecontroleerde effecten door integratie in het genoom voorkomen. Tot slot merken wij op dat het verplicht is om BAF60C kenbaar maken vóór of tegelijk als MyoD (nooit na) om hESC conversie behalen in skeletspieren. De vereiste van een voorafgaande uiting van BAF60C vermoedelijk vertrouwt op zijn rol in de pre-setting de epigenetische landschap voor een goede MyoD chromatine distributie via het genoom 6,15. Als zodanig kan de toekomstige protocollen worden verbeterd door stoffen of andere manipulaties die BAF60C expressie in hESCs bevorderen.
The authors have nothing to disclose.
PLP is een Associate Investigator van Sanford Children's Health Research Center. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan PLP: R01AR056712, R01AR052779 en P30 AR061303 van het National Institute of Health / Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten (NIAMS), MDA en Sanford Children Health Research award. Dit werk is gedeeltelijk geprofiteerd van de financiering van onderzoek van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap in het project-Health FP7 – 2009 ENDOSTEM 241.440 (Activering van vaatstelsel geassocieerde cellen en spieren stamcellen voor de reparatie en het onderhoud van spierweefsel) SA werd ondersteund door. CIRM fellowship.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |