Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.
Erzeugung eines homogenen und reichlich Population von Skelettmuskel-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES) ist eine Voraussetzung für zellbasierte Therapien und für eine "Krankheit in einer Schale"-Modell der menschlichen neuromuskulären Erkrankungen. Haupthürden, wie geringe Fülle und Heterogenität der Population von Interesse, als auch einen Mangel an Protokollen für die Bildung von dreidimensionalen Strukturen kontraktilen haben die Anwendungen von Stammzellen für die neuromuskuläre Störungen begrenzt. Wir haben ein Protokoll, das diese Grenzen überwindet in hESCs von Eileiter Einführung von definierten Faktoren entwickelt – der Muskel Bestimmung Faktor MyoD und SWI / SNF Chromatin-Remodeling-Komplex-Komponente BAF60C -, die in der Lage, hESCs in den Skelettmuskel-Zellen umzuprogrammieren sind. Hier beschreiben wir das Protokoll eingerichtet, um hESC-abgeleiteten Myoblasten zu generieren und ihre Clusterbildung fördern in miniaturisierten dreidimensionalen Strukturen (myospheres), die funktionell nachahmen miniaturisierten Skelettmuskulatur 7 </sup>.
Aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit zur Selbsterneuerung unter Beibehaltung Pluripotenz werden menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) als eine wertvolle Ressource in der regenerativen Medizin. Stammzell-vermittelten Wiederbesiedlung der erkrankten Muskeln und hES-oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS)-abgeleiteten Generation der Skelettmuskulatur für die in vitro-Krankheit Modellierung sind wichtige Ziele der Studien zu identifizieren Behandlungen und die Aufklärung der Pathogenese vieler neuromuskuläre Erkrankungen ausgerichtet. Allerdings haben diese Studien durch den Widerstand von HES in Skelettmuskelzellen umwandeln und durch den Mangel an Informationen über die molekulare Regulation von hES-Engagement in Richtung Skelett myogenesis fochten. Tatsächlich bisherigen Versuche, Skelettmuskelvorläuferzellen aus hES-Zellen zu erzeugen, ergab, dass nur Embryoidkörper (EB)-abgeleiteten Nachkommen oder mesenchymalen Zellen zuständig Skelett myogenesis aktivieren folgende ektopische Expression von Transkriptionsaktivatoren sind (zBPax3 oder Myf5) 1-3 oder durch Bestrahlen mit spezifischen Kulturbedingungen 5.4.
Wir haben zuvor gezeigt, dass die SWI / SNF-Komponente BAF60C (durch SMARCD3 kodiert) ist eine wesentliche Komponente der Transkriptionsmaschinerie, die MyoD-vermittelte Aktivierung von Muskel-spezifische Loci 6 ermöglicht. Wir haben vor kurzem entdeckt, dass die selektive Fehlen BAF60C verleiht hESCs auf den Widerstand gegen die MyoD vermittelte Aktivierung der Skelett myogenesis 7, die sonst in BAF60C beobachtet ausdrückt somatischen Zellen 8-10, ein Prozess allgemein als myogenen Umwandlung bezeichnet. Zwangs Ausdruck BAF60C ermöglicht MyoD Skelett myogenesis direkt in hESCs aktivieren, auf bestimmte Kulturbedingungen mit BAF60C und MyoD Einführung eines epigenetischen Signatur, die in Richtung der hESCs myogenen Linie 7 verpflichtet. Zu beachten ist, offenbart vorherigen Proteomanalyse die selektive Fehlen BAF60 ° C unter den SWI / SNF-Komponenten, WSR 11. Wir haben dieses Wissen, um eine epigenetische Engagement von HES auf den myogenen Linie zu verhängen, die zur Erzeugung eines homogenen Population von Skelettmyoblasten, die aggregiert werden könnten, um dreidimensionale Kontraktions bilden Strukturen (myospheres), die funktionell nachahmen miniaturisierten Skelettmuskulatur 7. Tat unsere Verfahren zur Erzeugung von Skelettmuskelvorläuferzellen aus hES-Zellen beruht auf der epigenetischen Engagement von HES auf die myogenen Linie, die phänotypisch latent ist, bis die Zellen an Differenzierungssignale ausgesetzt ist, wie z. B. Zell Aggregation und Kultur in Differenzierungsmedium (siehe spezifische Protokoll). Diese Strategie erlaubt die Expansion einer homogenen Population von HES, die epigenetically Skelettmuskelabstammungslinie gebunden sind und geeignet, um die Bildung von dreidimensionalen kontraktilen myospheres die histologischen und funktionellen Eigenschaften der Skelett rekapitulierenMuskeln. Die myospheres liefern den ersten Beweis von miniaturisierten Muskeln nutzbare für eine "Krankheit in einer Schale"-Modell der Muskelkrankheiten. Wenn von Patienten gewonnen iPS erzeugt haben diese myospheres das Potenzial, langjährige Entwicklungsfragen aufzuklären und die Pathogenese der seltenen Krankheiten, zusätzlich zum Angebot das enorme Potenzial als Instrument für die Hochdurchsatz-Screening von therapeutischen Verbindungen. Wir merken auch, dass eine sofortige Auslesen myosphere Analyse könnte durch Immunhistochemie auf Abschnitte vorgesehen werden, wie in einem Protokoll, das von JoVE Gomes et al. Beschrieben 12
Die hier vorgeschlagene Protokoll beschreibt, wie man dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres) direkt aus hES-Zellen zu generieren. Die vorgeschlagene Strategie hat die beispiellose und außergewöhnliche Potenzial, Mini-Muskeln in Suspension, die als geeignet "Krankheit in einer Schale"-Modell für beide Screening-Tests und Entwicklungsstudien sein kann, zu produzieren. Darüber hinaus ist das Verfahren zur myospheres von hES erzeugen einfach und erfordert keine FACS-Sortierungsschritt während der Differenzierung, der typischerweise eine negative Auswirkung auf die Ausbeute an Zellen gewonnen erforderlich. Außerdem würde ein Sortierverfahren während der Differenzierung mit der Aggregation stören da sie eine Dissoziation der EB in einzelne Zellen.
Das vorgeschlagene Verfahren basiert auf der epigenetischen reprograming von HES mit bestimmten Faktoren, MyoD und BaAF60C, die nicht in pluripotenten embryonalen Stammzellen exprimiert basieren. MyoD und BAF60C bieten dem "Kern"-Protein-Komplex thMarkierungen an der genomischen Loci, von dem Transkriptions geht um die Skelett myogene Programm zu aktivieren. Die beiden Faktoren zu den Zellen durch lentivirale Infektionen geliefert und es ist daher wichtig, um eine hohe Effizienz der Infektion beider Faktoren in allen Zellen zu erhalten. Dies kann durch einen hohen Titer Viren oder Viren mit Selektionsmarkern ausgestattet erreicht werden. Kulturbedingungen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Optimierung des Ausmaßes der Muskeldifferenzierung. Wir schlagen vor, ein Serum-basierte Differenzierung Protokoll für die Differenzierung von hES-Zellen exprimieren MyoD/BAF60C in Cluster myogener Vorstufen, gefolgt von einer Inkubation in Serum-freien definierten Medium (das Insulin-Transferrin – ITS), um die Umwandlung von myogenen Vorläufersubstanzen in Skelett Myotuben zu erreichen. Es ist jedoch möglich, dass andere definierte Medien können eine gleiche oder bessere Muskeldifferenzierung zu erreichen. Eine Strombegrenzung des Protokolls ist, dass es für die Verwendung von fötalem Rinderserum, das neben enthalten stütztten viele tierische Proteine und Substanzen, zeigt viel-zu-viele Variationen. Dies kann zu geringeren Wirkungsgrad oder Heterogenität der myogenen Umwandlung innerhalb myospheres führen. Der Hinweis, nicht alle EB-Strukturen aus BAF60/MyoD-expressing hESCs abgeleitet sind myospheres; nämlich sind einige EB-Aggregate wie voll der Muskelfasern zusammen. Die Anzahl der myospheres normalerweise von hES BAF60C und MyoD exprimieren, abgeleitet aus 30 bis 60% variieren, wie durch Immunfärbung auf EB Abschnitte am Ende des Protokolls durchgeführt (siehe Ergebnisse) geschätzt. Ein möglicher Ansatz, um eine Kulturschale nur myospheres bereichern wäre, eine myogene Reporter zu verwenden. Dies würde die teilweise oder Verwerfen der nicht unterschieden EB-wie Cluster und Auswahl nur die myospheres.
Schließlich würde ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die zeitlichen Anforderungen der Faktoren eingeführt nützlich, um die Art der Lieferung zu verbessern. Zum Beispiel werden, wenn BAF60C und MyoD nur für sh erforderlichort Zeit zu "Kick" der Zellen in die richtige Richtung, Methoden auf Basis modifizierter mRNA Lieferung könnte angewendet werden. Im Gegensatz dazu, wenn die Faktoren für eine längere Zeit, bevor die Zellen nutzen ihre endogenen Proteinen benötigt wird, wäre ein episomaler Ansatz empfohlen werden, um die Variabilität und unkontrollierte Effekte durch die Integration in das Genom zu beseitigen. Schließlich ist zu beachten wir, dass es zwingend erforderlich, um BAF60C vor oder zur gleichen Zeit wie MyoD (nie nach), um hESC Umwandlung in Skelettmuskeln erreichen auszudrücken. Das Erfordernis der vorherigen Ausdruck BAF60C vermutlich verlässt sich auf seine Rolle bei der Voreinstellung der epigenetischen Landschaft für die richtige MyoD Chromatin Vertrieb über das Genom 6,15. Als solche könnten zukünftige Protokolle von Verbindungen oder andere Manipulationen, die BAF60C Ausdruck in hESCs Förderung verbessert werden.
The authors have nothing to disclose.
PLP ist Associate Investigator von Sanford Gesundheit von Kindern Research Center. R01AR056712, R01AR052779 und P30 AR061303 aus dem National Institute of Health / National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett-und Hautkrankheiten (NIAMS), MDA und Kinder Sanford Health Research award: Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien an PLP unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von der Forschungsförderung des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft in diesem Projekt profitiert FP7-Health – 2009 EndoStem 241440 (Aktivierung des Gefäßsystems verbunden Stammzellen und Muskel-Stammzellen für die Reparatur und Wartung von Muskelgewebe) SA wurde unterstützt. CIRM Gemeinschaft.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |