Здесь мы опишем протокол на основе эпигенетической перепрограммирования человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) к генерации гомогенную популяцию скелетных мышечных клеток-предшественников, которые в разрешающих условиях культивирования образуют трехмерные кластеры сократительных мышечных волокон (myospheres), которые воспроизводят биологические особенности человека скелетные мышцы.
Генерация однородной и обильной населения скелетных мышечных клеток из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) является необходимым условием для клеточной терапии и для "болезни в посудомоечной» модели нервно-мышечных заболеваний человека. Основные препятствия, такие как низкой численности и неоднородности населения интерес, а также отсутствия протоколов для формирования трехмерных сократительных структур, ограничили применение стволовых клеток для нервно-мышечных расстройств. Мы разработали протокол, который преодолевает эти ограничения по внематочной введения определенных факторов в ЭСК – определение мышцы фактором MyoD и SWI / ОЯТ хроматина сложный компонент BAF60C – которые способны перепрограммировать ЭСК в клетки скелетных мышц. Здесь мы опишем протокол создан для генерации чЭСК полученных миобластов и содействовать их кластеризацию в трехмерный миниатюрных структур (myospheres), который функционально мимические миниатюрных скелетные мышцы 7 </sup>.
Из-за их уникальной способности к самообновлению, сохраняя плюрипотентности, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) считаются бесценным ресурсом в регенеративной медицине. Стволовые клетки, опосредованного репопуляции больных мышц и чЭСК-или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC), полученных поколение скелетных мышц для моделирования болезни в пробирке являются ключевыми задачами исследований, направленных на выявление лечения и выяснения патогенеза многих нервно-мышечных заболеваний. Тем не менее, эти исследования были оспорены сопротивления ЭСК для преобразования в клетках скелетных мышц и скудностью информации о молекулярном регулирования чЭСК-приверженности к скелетной миогенеза. Действительно, предыдущие попытки генерировать скелетных предшественников мышечных от ЭСК показал, что только эмбриоидного тела (EB)-производные потомства или мезенхимальные клетки компетентны, чтобы активировать скелетных миогенез следующие эктопической экспрессии транскрипционных активаторов (например,Pax3 или Myf5) 1-3 или под воздействием конкретных условий культивирования 4-5.
Ранее нами было показано, что компонент SWI / ОЯТ, BAF60C (кодируется SMARCD3), является одним из важнейших компонентов транскрипционного аппарата, что позволяет MyoD-опосредованной активации мышц конкретных локусов 6. Недавно мы обнаружили, что селективный отсутствие BAF60C дает на чЭСК сопротивление MyoD-опосредованной активации скелетных миогенеза 7, который в противном случае, наблюдаемой в BAF60C выражения соматических клеток 8-10, процесс обычно называют миогенного преобразования. Усиленная экспрессия BAF60C позволяет MyoD чтобы непосредственно активировать скелетных миогенез в ЭСК, от конкретных условий культивирования, с BAF60C и MyoD внушительной эпигенетическую подпись, которая совершает ЭСК к миогенной линии 7. Следует отметить, что предыдущая протеомный анализ показал селективное отсутствие BAF60C, среди компонентов SWI / ОЯТ, в ЭСК 11. Мы использовали эти знания навязать эпигенетическую приверженность ЭСК на миогенной линии, что приводит к генерации однородной популяции скелетных миобластов, которые могут агрегатироваться с образованием трехмерной сократительной структуры (myospheres), которые функционально мимические миниатюрных скелетные мышцы 7. Действительно, наш метод генерации скелетные предшественники мышечных от ЭСК опирается на эпигенетической приверженности ЭСК к миогенной линии, которая является фенотипически скрытая пока клетки подвергаются дифференциации сигналов, таких как клетки агрегации и культуры в дифференциации среды (см. специальный протокол). Эта стратегия позволяет расширение однородной популяции ЭСК, которые эпигенетически привержены скелетных мышц линии и подходящий к образованию трехмерных сократительных myospheres что резюмировать гистологические и функциональные свойства скелетныхмышцы. В myospheres обеспечивают первое доказательство миниатюрных мышц эксплуатируемых для "болезни в посудомоечной» модели мышечных заболеваний. Когда генерируется из пациентов получены ИПСК, эти myospheres есть потенциал, чтобы выяснить давние вопросы развития и патогенеза редких заболеваний, в дополнение к предложению огромный потенциал в качестве инструмента для высокопроизводительного скрининга терапевтических соединений. Отметим также, что один непосредственный отсчет myosphere анализа может быть обеспечена с помощью иммуногистохимии на срезах, как описано в протоколе Юпитер по Гомес и др. 12.
Протокол, предложенный здесь описывается создание трехмерных кластеров сократительных мышечных волокон (myospheres) непосредственно из ЭСК. Стратегия, предложенная имеет беспрецедентный и огромный потенциал для производства мини мышцы в суспензии, которые могут быть пригодны в качестве "болезни в посудомоечной» модели для обеих скрининга и исследований в области развития. Кроме того, метод для генерации myospheres от ЭСК проста и не требует никаких шагов FACS сортировки во время дифференциации, которая обычно оказывает негативное воздействие на выход клеток, выделенных. Кроме того, сортировка процедура при дифференциации будет мешать агрегации, так как это подразумевает диссоциацию ИС на отдельные клетки.
Предложенный метод основан на эпигенетической перепрограммирования из ЭСК с конкретными факторами, MyoD и BaAF60C, которые не выражены в плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток. MyoD и BAF60C обеспечить «ядро» белковый комплекс йна знаки геномная локусов, из которых транскрипция протекает активировать скелетных миогенную программу. Эти два фактора доставляются в клетки посредством лентивирусных инфекций и поэтому решающее значение для получения высокой эффективности инфекции обоих факторов во всех клетках. Это может быть достигнуто с использованием высоких вирусы или вирусы титр наделенные маркеров селекции. Условия культивирования, также играют важную роль в оптимизации степень миогенной дифференцировки. Мы предлагаем протокол дифференциации сыворотки на основе для дифференциации MyoD/BAF60C выражающей ЭСК в кластеры миогенных прекурсоров, а затем инкубации в бессывороточной среде (содержащей инсулин трансферрин – ИТС) для достижения преобразования миогенных прекурсоров в скелетных мышечных трубках. Тем не менее, вполне возможно, что другие средах определенного состава может достичь такой же или лучший миогенный дифференциации. Один ограничение тока протокола является то, что она опирается на использование эмбриональной телячьей сыворотки, которая, к тому же содержатING много животных белков и веществ, показывает много-к-много вариаций. Это может привести к снижению эффективности или неоднородности миогенной преобразования в myospheres. Следует отметить, что не все EB-как структуры, полученные из BAF60/MyoD-expressing ЭСК являются myospheres; а именно, некоторые агрегаты EB-подобные полностью состоит из мышечных волокон. Количество myospheres обычно полученных из ЭСК, экспрессирующих BAF60C и MyoD может варьироваться от 30 до 60% по оценкам иммунного окрашивания на EB секций, выполненных в конце протокола (см. результаты). Потенциальный подход для обогащения культуры блюдо для всего myospheres бы использовать миогенную репортер. Это будет способствовать отбрасывая частично или не дифференцированные EB-как кластеры и выбрав только myospheres.
И наконец, лучшее понимание механизмов, лежащих в основе временных требований факторов, введенных бы полезно улучшить метод доставки. Например, если BAF60C и MyoD требуются только для шорт время "удар" клеток в правильном направлении, методы, основанные на модифицированной доставки мРНК могут быть применены. Напротив, если факторы необходимы для более длительного времени, прежде чем клетки эксплуатировать свои внутренние белки, эписомными подход был бы рекомендован для устранения изменчивости и неконтролируемых последствий в связи с интеграцией в геноме. Наконец, отметим, что он является обязательным, чтобы выразить BAF60C до или в то же время, как MyoD (никогда после) в целях достижения преобразование чЭСК в скелетных мышцах. Требование предварительного выражения BAF60C предположительно зависит от его роли в предварительной настройки эпигенетическую ландшафт для правильного распределения MyoD хроматина через генома 6,15. Таким образом, будущие протоколы могут быть улучшены за счет соединений или других манипуляций, которые способствуют BAF60C выражение в ЭСК.
The authors have nothing to disclose.
ПЛП является младший следователь Научно-исследовательского центра здравоохранения Sanford детей. Эта работа была поддержана следующих грантов PLP: R01AR056712, R01AR052779 и P30 AR061303 из Национального института здравоохранения / Национального института артрита и костно-мышечной и кожных заболеваний (NIAMS), MDA и Sanford детей исследованиям в области здравоохранения премию. Эта работа частично воспользовались финансирования научных исследований из Седьмой рамочной программы Европейского сообщества в проекте FP7-здоровье – 2009 ENDOSTEM 241440 (Активация сосудистой связанных стволовых клеток и мышечных стволовых клеток для ремонта и технического обслуживания мышечной ткани) SA была поддержана. CIRM общение.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |