Organización helicoidal de sangre Coagulación Factor VIII en lípidos nanotubos
Summary
Se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica, la nanotecnología de lípidos, y análisis de la estructura aplicada para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas: humanos y porcinos. La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe.
Abstract
Crio-microscopía electrónica (Cryo-EM) 1 es un enfoque poderoso para investigar la estructura funcional de las proteínas y complejos en un entorno de estado y de la membrana hidratada 2.
Factor de coagulación VIII (FVIII) 3 es un multi-dominio de la glicoproteína del plasma sanguíneo. Defecto o deficiencia de FVIII es la causa para el tipo de hemofilia A – un trastorno hemorrágico grave. Tras la activación proteolítica, de FVIII se une a la serina proteasa Factor IXa en la membrana plaquetaria cargados negativamente, lo cual es crítico para la coagulación normal de la sangre 4. A pesar del papel fundamental FVIII juega en la coagulación, la información estructural de su estado unida a la membrana es incompleta 5. Concentrado de FVIII recombinante es el medicamento más eficaz contra la hemofilia tipo A y disponible comercialmente FVIII se puede expresar como ambos forman complejos funcionales con Factor humano IXa 6,7 humana o porcina,.
"> En este estudio se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica (crio-ME), el análisis de lípidos y la nanotecnología estructura aplicarse para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas:. Humano y porcino La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe. Los resultados representativos demuestran que nuestro método es suficientemente sensible para definir las diferencias en la organización helicoidal entre los dos altamente homóloga en secuencia (86% de identidad de secuencia ) proteínas. protocolos detallados para la organización helicoidal, Cryo-EM y tomografía electrónica ET adquisición de datos () se dan. Los dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) análisis de la estructura aplican para obtener las reconstrucciones en 3D de humano y porcino Se discute FVIII-LNT. Las estructuras humanas y porcinas presentados FVIII-LNT muestran el potencial de la metodología propuesta para Calculate la organización funcional, unido a la membrana del Factor VIII de coagulación sanguínea en alta resolución.Introduction
Factor de coagulación sanguínea VIII (FVIII) es una glicoproteína grande de 2332 aminoácidos organizados en seis dominios: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Tras la activación de trombina de FVIII actúa como cofactor para el factor IXa en el complejo activador unido a la membrana. La unión de FVIII activado (FVIIIa) de FIXa de una manera membrana dependiendo mejora FIXa eficiencia proteolítica más de 10 5 veces, que es crítico para la coagulación de la sangre eficiente 4. A pesar de la importante función de FVIII juega en la coagulación y la formación del complejo tenasa, la estructura de FVIII unido a la membrana funcional todavía no se ha resuelto.
Para hacer frente a esto, los nanotubos única bicapa lipídica (LNT) ricos en fosfatidilserina (PS), capaces de unirse con alta afinidad de FVIII 8, 9 y se asemeja a la superficie de las plaquetas activadas se han desarrollado 10. Organización helicoidal consecutiva de FVIII unido a LNT ha demostrado ser efective para la determinación estructural de estado unida a la membrana FVIII por Cryo-EM 5. Funcionalizado LNT son un sistema ideal para estudiar la proteína-proteína y las interacciones proteína-membrana de proteínas asociadas a la membrana helicoidal organizados por Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM tiene la ventaja sobre los métodos estructurales tradicionales tales como la cristalografía de rayos X y RMN, como la muestra se conserva en más cercana a la ambiente fisiológico (tampón, membrana, pH), sin aditivos e isótopos. En el caso del FVIII, el estudio de la estructura unida a la membrana con esta técnica es aún más fisiológicamente relevantes, como la LNT se asemejan estrechamente por tamaño, forma y composición de los pseudópodos de las plaquetas activadas en donde los complejos de tenasa ensamblan in vivo.
Defectos y deficiencia de FVIII causa de la hemofilia A, un trastorno hemorrágico grave que afecta a 1 de cada 5.000 varones de la población humana 4, 6. La mayoría de los eterapia ffective para la Hemofilia A es la administración de toda la vida de FVIII recombinante humano (hFVIII). Una complicación importante de la terapia de FVIII recombinante La hemofilia A es el desarrollo de anticuerpos inhibidores para la forma humana que afecta aproximadamente al 30% de los pacientes de la hemofilia A 13. En este caso, se utiliza FVIII porcino (pFVIII) concentrado, como pantallas de FVIII porcino baja reactividad cruzada con anticuerpos inhibidores contra FVIII y forma complejos funcionales con FIXa humano 7 humana. El establecimiento de la organización unida a la membrana de ambos porcina y formas de FVIII humanos es importante entender las bases estructurales de la función y las repercusiones para la hemostasia sanguínea cofactor FVIII.
En este estudio, se describe una combinación de nanotecnología de lípidos, Cryo-EM, y análisis de la estructura diseñada para resolver la organización unido a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas. Los datos de Cryo-EM presentados y estructuras 3D para porci helicoidal organizadoFVIII NE y humano cargado negativamente en LNT muestran el potencial de la nanotecnología propuesto como base para la determinación de la estructura de FVIII y factores y complejos en un entorno fisiológico de la coagulación de la membrana unidos a la membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se presenta una metodología para diferenciar entre dos organizaciones unidas a la membrana de proteínas altamente homólogas: FVIII humano y porcino auto-ensamblado en nanotubos de lípidos en las condiciones encontradas en el cuerpo humano.
En el procedimiento descrito, humana y FVIII porcino se organizan con éxito helicoidalmente en nanotubos de lípidos, que es el paso más crítico. El siguiente paso fundamental es preservar la muestra en hi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por una beca de Desarrollo Nacional Científico de la Asociación Americana del Corazón: 10SDG3500034 y UTMB-BCN en marcha los fondos de SSM. Los autores reconocen las instalaciones Cryo-EM y Computación Científica en el Centro de Sealy de Biología Estructural en UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), así como los Dres. Steve Ludtke y Ed Egelman ayuda con los algoritmos de reconstrucción helicoidales en 2D y 3D.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
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