Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Amplificazione Microarray
Summary
Un microarray amplificazione combina asimmetrica amplificazione PCR e ibridazione microarray in una sola camera, che semplifica significativamente workflow microarray per l'utente finale. La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray, che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse.
Abstract
La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray-MDR-TB che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse. Un microarray di amplificazione combina asimmetrica PCR, selezione del formato di destinazione, l'etichettatura di destinazione e microarray ibridazione all'interno di un'unica soluzione e in una sola camera microfluidica. Un metodo di elaborazione batch è dimostrato con un 9-plex master mix asimmetrico e bassa densità elemento gel microarray per la genotipizzazione multi-droga Mycobacterium tuberculosis resistenti (MDR-TB). Il protocollo qui descritto può essere completato in 6 ore e fornire corretta genotipizzazione con almeno 1.000 equivalenti cellulari di DNA genomico. Incorporando on-chip fasi di lavaggio è fattibile, che si tradurrà in un metodo amplicone interamente chiuso e sistema. Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è in definitiva limitata dal numero di coppie di primer che possono essere combinati in un unico master mix e ancora ottenere una sensibilità desiderata e metriche di performance specificità, piuttosto che il numero di sonde che sono immobilizzati sulla matrice. Allo stesso modo, il tempo di analisi totale può essere accorciato o allungato in funzione dell'uso specifico previsto, domanda di ricerca, e limiti desiderati di rilevamento. Tuttavia, l'approccio generale semplifica notevolmente workflow microarray per l'utente finale, riducendo il numero di fasi di elaborazione manualmente intensivo e richiede tempo, e fornisce un percorso biochimico e microfluidica semplificata per tradurre diagnostici basati su microarray nella pratica clinica di routine.
Introduction
Rilevamento caso precoce e un trattamento rapido sono considerate le strategie di controllo più efficaci per ridurre Mycobacterium tuberculosis (MTB) trasmissione 1, e ora c'è un ampio consenso nella comunità TB che un punto di assistenza (POC) o in prossimità POC test per diagnosticare contemporaneamente TB ed è necessaria resistenza ai farmaci (DR). Tecnologie come GeneXpert di Cefeidi e di altri test di amplificazione degli acidi nucleici riducono il tempo di diagnosi per molti pazienti affetti da tubercolosi, e di fornire una rapida read-out che indica la resistenza alla rifampicina o mutazioni selezionate che conferiscono resistenza agli altri prima o farmaci di seconda linea 2. Sebbene i test di amplificazione in tempo reale e di acido nucleico isotermica sono progettati per identificare le mutazioni di resistenza ai farmaci che portano a MDR-TB, lo spettro di mutazioni che scoprono è spesso insufficiente per progettare un regime individualizzato farmaco corrispondente al profilo farmacoresistenza del paziente, e vincoli tecnici connessidi ottica cross-talk o la complessità di amplificazione e di reporting chimiche 3-7 maggio limitare il numero di loci o mutazioni che vengono rilevati. Così, tecnologie di rilevazione con una maggiore capacità di multiplexing sono necessari per colmare le lacune note nella diagnostica POC MDR-TB.
Microarray e le Hain saggi sonda linea OMS-omologati possono affrontare il "gene multipla, mutazioni multiple" sfida di diagnosticare MDR-TB 8-29. Purtroppo, questi, piattaforme di rilevamento multiplex a base di ibridazione-usano più fasi, complicato, e protocolli open-ampliconi che richiedono una formazione significativa e competenza in tecniche molecolari. Il microarray di amplificazione 30 è stato progettato per affrontare alcuni di questi microarray flusso di lavoro e le preoccupazioni operative. I principi fluidici di semplificazione sono per amplificare, ibridare, e individuare gli obiettivi di acido nucleico all'interno di una singola camera di microfluidica. L'utente introduce i mas acidi e amplificazione dell'acido nucleicoter miscela in una camera fluidico con una pipetta e attiva il protocollo di cicli termici. Per il metodo di elaborazione batch mostrato qui, microarrays sono successivamente lavati in soluzione bulk, essiccati, e ripreso. Questo studio dimostra la funzionalità di un microarray di amplificazione mediante test di MDR-TB microarray per rpoB (30 mutazioni), katG (2 mutazioni), inhA (4 mutazioni), rpsL (2 mutazioni), embB (1 mutazione), IS1245, IS6110 , e un amplificazione interna e controllo ibridazione. Almeno una coppia di sonde microarray (di tipo selvatico (WT) e single-nucleotide mutanti (MU)) è incluso per ogni mutazione di interesse. Acidi nucleici purificati da multi-farmaco resistente M. tubercolosi sono dal ceppo TDR Tubercolosi Bank 31. Microarrays elemento Gel sono realizzati su substrati di vetro per copolimerizzazione essenzialmente come descritto altrove 32, tranne che usiamo 4% monomero e 0,05 mm ciascuna sonda nel polymerizmiscela zione. Array sono circondati da una guarnizione 50 ml prima dell'uso. Dopo cicli termici, di ibridazione e di lavaggio gradini, microarrays amplificazione vengono esposte su un analizzatore portatile Akonni. , Intensità di segnale integrati Sfondo correzione sono ottenuti dal greggio. Immagini tif utilizzando un algoritmo cerchio fisso. Rumore per ciascun elemento gel è calcolato come tre volte la deviazione standard degli sfondi posto locale. Obiettivi del gene sono in genere considerati rilevabile per il rapporto segnale-rumore (SNR) valori ≥ 3. Per determinare la presenza o l'assenza di una specifica mutazione in ogni gene o codone, un rapporto discriminante è calcolato dai valori SNR (WT-MU) / (WT + MU). Rapporti discriminanti <0 sono indicativi di un farmaco-resistenza mutazione al locus, mentre i rapporti> 0 sono indicativi della sequenza wild-type.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è infine dettata dall'efficienza del multiplex PCR asimmetrica, non microarray. Nella nostra esperienza, 10-12 coppie di primer uniche possono essere facilmente multiplexing in un formato di amplificazione microarray. Criteri di progettazione di primer e sonde convenzionali applicano a nuovi saggi, salvo che uno deve anche considerare potenziali interazioni tra acidi nucleici soluzione monofase e sonde immobilizzate microarray, l'efficienza termica del …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) in concessione RC3 AI089106.
Acidi nucleici MDR-TB sono stati forniti dal / Mondo del Programma delle Nazioni Unite Programma di sviluppo Fund / Nazioni Unite Banca / Organizzazione Mondiale della Sanità Speciale per la Ricerca e la Formazione in malattie tropicali (TDR), Ginevra, Svizzera.
Ringraziamo il Dr. Tom Shinnick dei Centri statunitensi per il Controllo e la Prevenzione delle malattie per indicazioni sui geni e mutazioni specifiche da includere nel test del prototipo.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
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